双管齐下：计算机筛选同时发现能靶向SARS-CoV-2聚合酶两个位点的小分子抑制剂

本文信息

标题：通过计算机辅助药物发现方法鉴定出能阻断病毒复制的、可双位点抑制SARS-CoV-2 RNA依赖性RNA聚合酶的小分子
作者：Paolo Malune, Daniela Iaconis, Candida Manelfi, Stefano Giunta, Roberta Emmolo, Filippo Lunghini, Annalaura Paulis, Carmine Talarico, Angela Corona, Andrea Rosario Beccari, Enzo Tramontano, Francesca Esposito*
发表时间：2025年9月26日
单位：意大利卡利亚里大学（University of Cagliari）、意大利Dompe制药公司EXSCALATE平台
引用格式：Malune, P., Iaconis, D., Manelfi, C., Giunta, S., Emmolo, R., Lunghini, F., Paulis, A., Talarico, C., Corona, A., Beccari, A. R., Tramontano, E., & Esposito, F. (2025). Dual-Site Inhibition of SARS-CoV-2 RNA-Dependent RNA Polymerase by Small Molecules Able to Block Viral Replication Identified through a Computer-Aided Drug Discovery Approach. ACS Infectious Diseases, 11(9), 2821–2835. https://doi.org/10.1021/acsinfecdis.5c00517

摘要

自2019年底出现以来，SARS-CoV-2（COVID-19的病原体）持续在全球传播，截至2025年3月报告的死亡病例已超过700万。在病毒的非结构蛋白中，nsp12作为RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），与其辅助因子nsp7和nsp8共同介导病毒基因组的复制和转录。迄今为止，只有两种靶向SARS-CoV-2 nsp12的核苷类似物（瑞德西韦和莫努匹拉韦）获得FDA授权用于COVID-19治疗。为满足对额外安全有效抗病毒药物的需求，我们利用EXSCALATE平台，针对SARS-CoV-2 nsp12/7/8复合物，筛选了两个广泛的“安全用于人体”化合物库（>9000个）和天然化合物库（>249，000个），靶向正构位点和两个变构位点。随后根据对接打分显著性、靶点新颖性和临床安全性筛选化合物。前119名候选分子随后在生化实验中被评估抑制SARS-CoV-2 nsp12/7/8聚合酶活性的潜力，42个化合物被鉴定出具有抑制能力，其中4个显示出纳摩尔或低微摩尔范围的IC₅₀和EC₅₀值。在基于细胞的实验中评估它们对SARS-CoV-2复制的效力时，它们被证实在相同浓度范围内具有抑制作用。作用机制研究揭示了不同的抑制模式。这些结果为开发靶向RdRp活性位点和变构位点的新型抗SARS-CoV-2化合物奠定了基础，进一步表明计算机辅助药物发现（CADD） 方法与实验验证相结合，可为加速抗病毒药物研发提供基础。

核心结论

高效虚拟筛选：通过对超过25万个化合物（包括已上市或临床阶段药物及天然产物）进行大规模分子对接虚拟筛选，成功将候选范围从数万缩小至百余个。
发现新型抑制剂：经过生化与细胞实验验证，从筛选出的119个分子中，最终鉴定出4个能有效抑制SARS-CoV-2 RdRp酶活性和病毒复制的先导化合物，其IC₅₀/EC₅₀值在纳摩尔至低微摩尔范围。
明确双位点作用机制：研究发现，效力最强的两个化合物（孟加拉玫瑰红和维奈托克）分别结合于RdRp的催化活性中心和掌状区的变构位点，并通过动力学实验证实了它们分别为混合型和非竞争性抑制剂。
揭示“老药新用”潜力：发现的先导化合物中包括孟加拉玫瑰红（一种历史悠久的诊断染料）和维奈托克（一种已获批的BCL-2抑制剂抗癌药），为药物重定位策略抗病毒提供了新线索。

背景

SARS-CoV-2疫情已持续数年，尽管疫苗和部分抗病毒药物已投入使用，但病毒仍在持续演变和传播，给全球公共卫生带来长期压力。病毒基因组复制和转录的核心机器——RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），因其在病毒生命周期中的关键作用及在RNA病毒间的保守性，成为极具吸引力的抗病毒药物靶点。

目前，仅有少数靶向SARS-CoV-2 RdRp的药物获得批准，且各自存在局限。瑞德西韦作为核苷类似物，其疗效仍在评估中；莫努匹拉韦因其诱变机制可能促进病毒变异，已在欧洲撤市。这凸显了开发具有新作用机制、更高安全性RdRp抑制剂的紧迫性。

传统的药物发现耗时长、成本高。计算机辅助药物发现（CADD） 技术，特别是大规模的虚拟筛选，能够快速从海量化合物库中锁定潜在苗头化合物，极大加速了早期发现进程。其中，针对已具备良好人用安全性数据的化合物库（“老药”或临床阶段药物）进行筛选的药物重定位策略，因能显著缩短研发周期和降低风险而备受青睐。

关键科学问题

如何超越现有核苷类似物：能否发现不依赖于链终止或诱变机制的新型、高效、非核苷类SARS-CoV-2 RdRp抑制剂？
如何应对靶点变异性：除了高度保守的催化活性中心，能否靶向RdRp的其他变构位点，以提供更广谱或更难产生耐药性的抑制策略？
如何加速发现进程：如何将大规模计算筛选（CADD）与高效实验验证紧密结合，快速、可靠地从数十万化合物中甄别出有潜力的先导分子？

创新点

大规模多靶点虚拟筛选：首次对包含上市药物、临床阶段化合物及大量天然产物的超大规模化合物库，针对SARS-CoV-2 RdRp复合物的一个正构位点和两个变构位点同时进行系统性的分子对接筛选。
严格的“从计算到实验”验证流程：建立了从虚拟对接→基于新颖性和打分筛选→生化酶活抑制验证→细胞水平抗病毒验证→作用机制与动力学研究的完整闭环研究体系。
发现双作用位点的先导化合物：不仅发现了抑制活性位点的化合物（如孟加拉玫瑰红），更鉴定出作用于掌状区变构位点的抑制剂（如维奈托克），并阐明了其不同的抑制动力学模式。

研究内容

整体研究策略与筛选流程

本研究采用了一种计算与实验紧密结合的策略来发现新型SARS-CoV-2 RdRp抑制剂。核心思路是：首先利用高性能计算平台对超大规模化合物库进行分子对接虚拟筛选，快速聚焦到少量高潜力候选分子；然后通过一系列逐步严格的生物化学和细胞生物学实验，验证这些候选分子的抑制活性、抗病毒效果和作用机制。

整个研究过程可以通过下面的流程图清晰地展示：

graph TB
    subgraph S1["第一阶段：大规模虚拟筛选"]
        A["两个化合物库<br/>超过25万个分子"] --> B["分子对接<br/>靶向3个位点"]
        B --> C["筛选标准"]
        C --> D1["靶点新颖性<br/>排除已知抑制剂"]
        C --> D2["对接打分显著性<br/>大于均值加2倍标准差"]
        C --> D3["临床安全性和可及性<br/>安全人用库优先"]
        D1 & D2 & D3 --> E["最终候选池：119个化合物"]
    end
    subgraph S2["第二阶段：逐级实验验证"]
    direction LR
        F["初级生化筛选<br/>浓度100微摩尔<br/>抑制率大于50%"]
        F --> G["42个初筛阳性化合物"]
        G --> H["剂量响应曲线测定IC50"]
        H --> I["13个IC50小于20微摩尔<br/>4个最有效化合物<br/>IC50小于10微摩尔"]
        I --> K["细胞水平抗病毒实验<br/>测定EC50"]
    end

    subgraph S3["第三阶段：深入机理研究"]
        M1["竞争性动力学实验"]
        M2["分子动力学模拟<br/>250纳秒模拟"]
        M1 & M2 --> N["明确结合位点与抑制模式"]
    end
	S1 --> S2 --> S3

核心方法详述

1. 虚拟筛选平台与流程

化合物库准备：
- “安全人用”库：包含约1万个已上市、处于临床阶段或曾中止开发的药物分子，来源于Cortellis、DrugBank等数据库。
- 天然产物库：包含约25万个来源于天然产物的分子。
- 所有分子使用Schrödinger LigPrep进行3D结构生成、质子化状态和 tautomer 枚举，并用OPLS3力场进行能量最小化。
蛋白靶点与对接位点：
- 使用SARS-CoV-2 nsp12/nsp7/nsp8复合物的冷冻电镜结构（PDB：7BV2）。
- 定义了三个对接位点：
  1. 正构位点（催化活性中心）：瑞德西韦结合的位置。
  2. 变构位点1（掌状区，Palm）：靠近NTP进入通道的区域。
  3. 变构位点2（拇指区，Thumb）：另一个潜在的变构调节区域。
对接引擎与筛选：使用 Dompé 公司专有的 LiGen 对接软件进行刚性几何匹配和打分。筛选标准严格，首先排除文献已报道的RdRp抑制剂，然后保留对接优化打分（CSopt）高于该位点平均值两个标准差以上的分子。对于“安全人用”库的分子，还额外要求其至少通过临床Ⅰ期试验，以确保安全性基础。

2. 生化与细胞实验体系

RdRp酶活测定：建立并优化了基于引物延伸-尿素PAGE的生化实验。使用Cy5标记的RNA引物与模板，在含有纯化的SARS-CoV-2 RTC（nsp12/7/8复合物）的体系中进行反应，通过凝胶电泳和密度定量来评估酶活性和化合物抑制效果（图2）。

图2：SARS-CoV-2 RdRp酶活测定方法的建立与优化。（A）RNA引物/模板示意图，引物5’端用Cy5荧光标记。（B）不同MgCl₂浓度下的RNA延伸产物凝胶电泳图。（C）反应时间进程曲线，显示线性范围约30分钟。（D）nsp12/nsp7/nsp8比例优化结果。

图2：RdRp酶活测定优化

酶动力学参数测定：通过测定不同底物浓度下的初始反应速度，建立酶促反应动力学曲线。使用Lineweaver-Burk双倒数图确定米氏常数（$K_M$）和最大反应速度（$V_{max}$），为后续抑制剂机制研究提供基础（图3）。

图3：SARS-CoV-2 RdRp酶动力学参数测定。（A,B）RNA底物和（C,D）GTP底物的Michaelis-Menten动力学曲线和Lineweaver-Burk双倒数图，显示RdRp的动力学常数（$K_M$：RNA 0.39 nM，GTP 27.4 μM）。

图3：RdRp酶动力学常数

细胞水平抗病毒实验：在Vero E6细胞系中，用SARS-CoV-2病毒感染细胞，并加入不同浓度的化合物。通过噬斑测定法计算病毒滴度，评估化合物抑制病毒复制的效果（EC₅₀）和对细胞的毒性（CC₅₀）。

3. 作用机制研究方法

酶动力学分析：通过测定在不同化合物浓度下，酶促反应速度随底物（RNA模板或GTP）浓度的变化（米氏曲线），并绘制双倒数图（Lineweaver-Burk图），来推断抑制剂的抑制类型（竞争性、非竞争性、混合型等）。
分子动力学模拟：对化合物-蛋白复合物进行250 ns的分子动力学模拟，分析配体与蛋白的均方根偏差（RMSD），评估结合构象的稳定性，从动态角度验证对接结果。

主要研究结果

1. 虚拟筛选成功富集活性分子

如图1所示，通过对两个庞大化合物库的逐步筛选，最终从超过25万个初始分子中，聚焦到119个高潜力候选化合物进行实验测试（47个来自”安全人用”库，72个来自天然产物库）。这种严格的计算机预筛选，为后续高效率的实验验证奠定了基础。

图1：虚拟筛选流程示意图。展示了从超过25万个化合物到最终119个候选分子的筛选流程，包括三个阶段的逐步过滤：虚拟筛选、基于三个标准的计算筛选（靶点新颖性、对接打分显著性、临床安全性），以及最终的实验验证。

图1：筛选流程示意图

2. 发现高效抑制RdRp酶活性的先导化合物

在119个受试化合物中，42个（占35%）在100 μM浓度下能抑制超过50%的RdRp酶活性。进一步测定这42个化合物的半数抑制浓度（IC₅₀），其中13个IC₅₀值低于20 μM，更有4个化合物显示出低于10 μM的强效抑制能力（表1）。

表1：鉴定出的最强效RdRp抑制剂概览

表1：RdRp抑制剂活性数据

化合物	来源库	预测结合位点	IC₅₀ (μM)
孟加拉玫瑰红	“安全人用”库	催化活性中心	0.25 ± 0.0036
维奈托克	“安全人用”库	掌状区（Palm）	2.37 ± 0.42
3-O-乙酰基-11-酮-β-乳香酸	天然产物库	催化活性中心	4.98 ± 1.44
化合物4	天然产物库	催化活性中心	8.21 ± 4.87

IC₅₀：抑制50% SARS-CoV-2 RTC酶活性所需的化合物浓度。数据为至少3次独立实验的平均值±标准差。

3. 先导化合物在细胞水平有效抑制病毒复制

最关键的一步验证是，这4个在生化水平表现最佳的化合物，能否在真实的病毒感染模型中发挥作用。细胞实验结果表明，它们在纳摩尔至低微摩尔浓度下就能有效抑制SARS-CoV-2的复制，且在该浓度下对宿主细胞无明显毒性（表2）。例如，孟加拉玫瑰红的抗病毒EC₅₀为0.18 μM，选择性指数（CC₅₀/EC₅₀）大于546，显示出优异的治疗窗口。

表2：先导化合物的抗病毒活性与选择性

化合物	EC₅₀ (μM) *	CC₅₀ (μM) †	选择性指数 ‡
孟加拉玫瑰红	0.18 ± 0.02	>100	>546.5
维奈托克	0.85 ± 0.08	>100	>117.9
3-O-乙酰基-11-酮-β-乳香酸	4.81 ± 2.15	>100	>20.8
化合物4	2.61 ± 0.18	>100	>38.36
GC376 (阳性对照)	0.06 ± 0.03	>100	>5,882

EC₅₀：抑制50% SARS-CoV-2复制所需的化合物浓度。†CC₅₀：使50% Vero E6细胞活力下降的化合物浓度。‡选择性指数 = CC₅₀ / EC₅₀。

4. 阐明两种不同的作用机制

对两个效力最强的化合物（孟加拉玫瑰红和维奈托克）进行了深入的机制研究。

孟加拉玫瑰红：混合型抑制催化位点

分子对接预测其结合在催化活性中心，与关键残基Arg553、Arg555和Lys551相互作用（图4）。酶动力学实验显示，它同时影响酶对底物RNA和GTP的表观V_max和K_M值，双倒数图交点在横轴下方，表明它是一种混合型抑制剂（图6）。这可能意味着它既能干扰底物结合，也能影响酶-底物复合物的催化效率。

图4：孟加拉玫瑰红与SARS-CoV-2 nsp12催化位点的预测结合模式。（A）孟加拉玫瑰红（紫色 sticks）与瑞德西韦单磷酸（绿色 sticks，来自PDB 7BV2）在催化位点的结合模式叠加图，显示两者占据相似的结合位置。（B）预测的孟加拉玫瑰红与催化位点关键氨基酸残基（如Arg553、Arg555、Lys551等）的相互作用二维示意图，展示氢键和疏水相互作用网络。

图4：孟加拉玫瑰红的结合模式

图6：孟加拉玫瑰红对SARS-CoV-2 RdRp的酶动力学抑制曲线。（A,C）不同孟加拉玫瑰红浓度（0、0.1、0.25、0.5、1 μM）下，RNA底物和GTP底物的Michaelis-Menten动力学曲线，显示随着抑制剂浓度增加，V_max逐渐降低，K_M也逐渐变化。（B,D）相应的Lineweaver-Burk双倒数图，直线交点位于第二象限（横轴下方），这是混合型抑制的典型特征。

图6：孟加拉玫瑰红的动力学曲线

维奈托克：非竞争性抑制变构位点

对接预测其结合在掌状区的一个变构位点，与Arg836和His439等残基相互作用（图5）。动力学实验表明，它只降低酶促反应的V_max，而不改变K_M，双倒数图显示一组平行线，这是典型的非竞争性抑制剂特征（图7）。这表明维奈托克不直接与底物竞争结合位点，而是通过结合变构位点来降低酶的催化效率。

图5：维奈托克与SARS-CoV-2 nsp12掌状区变构位点的预测结合模式。（A）维奈托克（橙色 sticks）结合在nsp12掌状区变构位点的结合模式图，该位点远离催化中心。（B）预测的维奈托克与该位点氨基酸（Arg836、His439、Asn838等）的相互作用二维示意图，展示氢键和π-π堆积等非共价相互作用。

图5：维奈托克的结合模式

图7：维奈托克对SARS-CoV-2 RdRp的酶动力学抑制曲线。（A,C）不同维奈托克浓度（0、1、2.5、5、10 μM）下，RNA底物和GTP底物的Michaelis-Menten动力学曲线，显示随着抑制剂浓度增加，V_max逐渐降低，但K_M保持不变。（B,D）相应的Lineweaver-Burk双倒数图，显示一组平行线，这是非竞争性抑制的典型特征。

图7：维奈托克的动力学曲线

分子动力学模拟验证结合稳定性

对四个先导化合物的250 ns分子动力学模拟显示（图8、9），孟加拉玫瑰红和AKBA在催化位点的结合构象非常稳定，配体RMSD值在模拟后期趋于平稳，验证了对接预测的可靠性。而维奈托克在变构位点的结合诱导了蛋白构象的显著变化后趋于稳定，nsp12的RMSD值在初始阶段大幅波动后达到平衡，这与其非竞争性抑制通过构象变化发挥作用的机理相符。

图8：催化位点结合剂的分子动力学模拟。（A,C）孟加拉玫瑰红和AKBA在催化位点的配体RMSD随时间变化图，显示在250 ns模拟过程中配体构象保持稳定，RMSD值在2-3 Å范围内波动。（B,D）蛋白-配体复合物的总RMSD随时间变化，证实复合物整体构象稳定。

图8：催化位点MD模拟

图9：维奈托克在变构位点的分子动力学模拟。（A）维奈托克配体RMSD随时间变化，显示在初始20 ns内构象调整后趋于稳定。（B）nsp12蛋白RMSD随时间变化，显示在维奈托克结合后蛋白发生显著构象变化（RMSD在3-5 Å），随后达到新的平衡状态，这与变构抑制的机制一致。

图9：维奈托克MD模拟

Q&A

Q1：为什么选择“安全人用”化合物库进行筛选？这在实际药物开发中有什么优势？
A1：选择“安全人用”库（包含已上市或完成临床Ⅰ期试验的化合物）进行药物重定位筛选，具有多重显著优势：
1. 安全性已知：这些化合物已经通过了系统的临床前和（部分）临床安全性评价，其人体毒性、药代动力学等数据相对完善，大大降低了后续开发因安全性问题失败的风险。
2. 研发周期短、成本低：相较于从头开发全新化学实体，重定位现有药物可以省去大量的早期药物化学优化、临床前安全评价等工作，能够加速其进入抗病毒临床试验的进程。
3. 可快速应对疫情：在新发突发传染病（如COVID-19大流行）的背景下，这种策略能为快速寻找可用治疗手段提供一条捷径。
Q2：研究中如何区分和验证化合物是作用于催化位点还是变构位点？
A2：研究通过计算与实验相结合的策略进行区分和验证：
- 计算预测：初始的分子对接模拟即针对三个不同的位点（催化位点、掌状区、拇指区）分别进行，根据化合物的最佳对接位置给出初步预测。
- 动力学实验验证：这是最关键的一步。通过酶促反应动力学分析：
  - 若化合物表现为竞争性抑制（仅改变K_M），通常强烈提示其与底物结合在相同或重叠的位点（即催化位点）。
  - 若表现为非竞争性抑制（仅改变V_max），则强烈提示其结合在不同于底物的变构位点，通过引起酶构象变化来影响催化功能。本研究中的维奈托克即属于此类。
  - 混合型抑制（同时影响K_M和V_max）可能意味着化合物结合在催化位点附近，既能部分阻碍底物进入，又影响催化构象。孟加拉玫瑰红被归为此类。
- 分子模拟佐证：分子动力学模拟显示，结合在变构位点的维奈托克引起了蛋白构象的显著弛豫，这与变构调节的机理一致。
Q3：论文中提到的先导化合物（如孟加拉玫瑰红、维奈托克）虽然体外活性不错，但它们的“成药性”如何？存在哪些挑战？
A3：论文在讨论部分和ADMET分析（表3）中也客观指出了这些先导分子在走向药物时面临的挑战：
- 理化性质与口服生物利用度：孟加拉玫瑰红和维奈托克分子量很大（>800 Da），且预测的脂溶性和水溶性不理想，这可能导致其口服吸收差，可能需要静脉给药等替代途径。
- 分布与代谢：所有化合物均被预测难以透过血脑屏障，这对于治疗可能影响中枢神经系统的病毒感染未必是劣势。值得肯定的是，它们均不是CYP3A4抑制剂，降低了引发严重药物相互作用的风险。
- 关于孟加拉玫瑰红：它是一种已知的光敏剂和蛋白沉淀剂，历史上曾用作诊断染料和局部治疗。其潜在的脱靶效应和光照下的毒性是需要严格评估的安全问题。其出色的体外活性为优化其类似物、降低不良反应指明了方向。
- 关于维奈托克：作为一种高效的BCL-2抑制剂，其强效的细胞凋亡诱导作用是其抗癌机制，但也可能带来细胞毒性。在抗病毒应用中，需要仔细评估其治疗窗口，确保在抑制病毒所需的剂量下不会对正常细胞造成不可接受的伤害。

关键结论与批判性总结

核心贡献

方法学贡献：成功实践了一套从超大规模虚拟筛选到多层次实验验证的高效计算机辅助药物发现流程，证明了CADD在快速发现抗病毒先导化合物方面的强大能力。
科学发现：鉴定出4个具有纳摩尔至微摩尔级抗SARS-CoV-2活性的新型先导化合物，并首次明确揭示了其中两个（孟加拉玫瑰红和维奈托克）分别通过作用于催化中心和掌状变构位点来抑制RdRp，拓宽了靶向该关键病毒酶的策略。
资源与线索：为抗冠状病毒药物研发提供了新的化合物骨架和明确的变构结合位点信息，这些发现对于设计更高效、更不易产生耐药性的下一代广谱抗病毒药物具有重要参考价值。

局限性

机制验证深度：研究主要通过计算对接和酶动力学间接推断结合位点，缺乏直接的结构生物学证据（如共晶结构或冷冻电镜结构）来最终确证化合物与预测位点的精确结合模式。
成药性挑战：正如Q&A所讨论的，已发现的最强效先导化合物在溶解性、渗透性等类药性质上存在明显缺陷，距离成为理想的口服药物还有很长的化学优化道路要走。
体内效力未知：所有活性数据均来源于体外实验（酶活和细胞感染模型）。这些化合物在动物模型乃至人体内是否依然有效、其药代动力学和安全性如何，是完全未知的，这是未来转化的关键一步。
选择性未充分评估：研究主要关注了对病毒靶点的抑制，但未系统评估这些化合物（尤其是“老药”）对其他重要人体酶或受体的选择性，潜在的脱靶效应需要后续研究。

未来方向

结构生物学验证：通过X射线晶体学或冷冻电镜解析先导化合物与SARS-CoV-2 RdRp复合物的高分辨率结构，为基于结构的理性优化提供蓝图。
先导化合物优化：以孟加拉玫瑰红或维奈托克为起点，进行药物化学改造，旨在保持或提高其抗病毒效力的同时，显著改善其溶解度、代谢稳定性等成药性质。
临床前与体内研究：在更相关的动物感染模型（如人源化ACE2小鼠或仓鼠模型）中评估优化后化合物的体内药效和安全性，这是推进至临床试验的必要前提。
拓展抗病毒谱：鉴于冠状病毒RdRp的保守性，值得测试这些先导化合物对其他冠状病毒（如MERS-CoV、普通感冒冠状病毒）乃至其他具有类似RdRp的RNA病毒是否具有广谱抑制活性。

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