Unlocking T-Cell Proximity Control: How LAG-3 Proximity to TCR Enables Precision Autoimmune Therapy

【Cell】解锁免疫“刹车”新用法：强制T细胞“邻近”可精准治疗自身免疫病一、本文基本信息摘要在自身免疫性疾病中，针对致病性T细胞的治疗一直充满挑战。淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）是一种主要在活化T细胞上特异性表达的抑制性检查点受体，已知其可与主要组织相容性复合物II类分子（MHC-II）结合。然而，本研究表明，仅仅与MHC-II相互作用不足以实现LAG-3的最佳功能。相反，由同源肽-MHC-II分子介导的LAG-3与T细胞受体（TCR）的空间邻近性，而非与CD4共受体的邻近性，才是介导CD4+ T细胞抑制的关键。从机制上看，LAG-3通过其胞内FSAL基序与TCR信号组分CD3ε形成凝聚体，从而破坏CD3ε与淋巴细胞特异性蛋白激酶（Lck）的结合。为了利用LAG-3与TCR的邻近性并最大化其依赖的T细胞抑制作用，我们开发了一种Fc功能减弱的LAG-3/TCR抑制性双特异性抗体，以绕过对同源肽-MHC-II的需求。这种方法能够强效抑制CD4$^{+}$和CD8$^{+}$ T细胞，并有效缓解小鼠自身免疫模型的症状。我们的发现揭示了一种复杂且有条件的检查点调控机制，并强调了靶向LAG-3/TCR顺式邻近性对于治疗那些缺乏有效且耐受性良好的免疫疗法的T细胞驱动的自身免疫性疾病具有重要意义。原文引用信息 Du, J., Chen, H., You, J., Hu, W., Liu, J., Lu, Q.,… & Wang, J. (2025). Proximity between LAG-3 and the T cell receptor guides suppression of T cell activation and autoimmunity. Cell,88,-18. https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.06.004 二、研究背景与科学问题 2.1 免疫系统的“双刃剑”：自身免疫病的困境免疫系统是人体的精密防御体系，其核心职责是区分“自我”与“非我”，精准清除外来病原体，同时保护自身组织。然而，当这套精密的识别系统出现故障，免疫细胞便会错误地攻击自身健康的组织和器官，导致自身免疫性疾病的发生。这类疾病种类繁多，包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化症等，影响着全球数以亿计的人口。在许多自身免疫病中，T淋巴细胞（T细胞）的过度活化被认为是驱动疾病进展的核心元凶。近年来，自身免疫病的发病率在全球范围内，尤其是在工业化国家，呈现出快速上升的趋势。一个广受关注的理论是“卫生假说”（Hygiene Hypothesis）或其修正版“老朋友假说”（Old Friends Hypothesis）。该假说认为，现代社会过于洁净的环境、抗生素的广泛使用以及生活方式的改变，减少了人们在生命早期接触微生物的机会。这种暴露的缺乏可能导致免疫系统未能得到充分的“训练”和“教育”，使其调控机制发育不全，从而更容易对自身抗原产生过度反应，增加了患过敏性和自身免疫性疾病的风险。这一宏观背景凸显了深入理解免疫调控机制、开发新型精准免疫疗法的迫切性。 2.2 免疫检查点LAG-3：一个熟悉又陌生的“刹车”分子为了防止免疫反应过度而伤及自身，免疫系统进化出了一系列“刹车”机制，即免疫检查点。这些分子通常是表达在免疫细胞表面的抑制性受体，当它们被激活时，能够抑制免疫细胞的功能，维持免疫稳态。其中，淋巴细胞活化基因-3（LAG-3，又称CD223）是一个关键的抑制性检查点，主要在活化的T细胞上高表达。 LAG-3在结构上是CD4分子的同源物，属于I型跨膜蛋白，其胞外区包含四个免疫球蛋白（Ig）样结构域（D1-D4）。它最主要的配体是主要组织相容性复合物II类分子（MHC-II），同时也能够与纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）等其他分子结合。与更为人熟知的PD-1和CTLA-4检查点类似，LAG-3在癌症和慢性感染中标志着T细胞的“耗竭”状态。研究表明，LAG-3与PD-1常常在耗竭的T细胞上共表达，并通过互补的、非冗余的通路协同抑制T细胞功能。因此，靶向LAG-3已成为继PD-1/CTLA-4之后肿瘤免疫治疗的又一重要方向。 2.3 关键科学问题与核心创新点尽管LAG-3作为免疫“刹车”的重要性已广为人知，但一个核心的谜题长期悬而未决：LAG-3究竟是如何通过与配体结合，将抑制信号传递到细胞内部，从而精确地关闭T细胞的活化引擎的？其具体的分子作用机制一直不甚明了，被形容为一个“充满谜题的分子”。本项发表于《细胞》杂志的研究，正是为了解开这个谜题。研究团队通过一系列精巧的实验设计，取得了多项突破性进展，为我们描绘了一幅全新的LAG-3功能图景。其核心创新点可概括为：揭示了全新的“空间邻近依赖”抑制模型：颠覆了传统的“配体结合即激活”的认知，证明LAG-3的抑制功能需要其与T细胞受体（TCR）在空间上足够靠近才能实现。阐明了LAG-3在分子水平“釜底抽薪”的物理机制：发现LAG-3的胞内结构域可以直接干扰TCR早期信号通路中关键蛋白复合物的形成。基于新机制，开创性地设计了“激动型”双特异性抗体BiTS：将基础科学发现迅速转化为一种全新的治疗策略，通过人为强制LAG-3与TCR的邻近来增强其抑制功能。在多种自身免疫病动物模型中验证了BiTS的强大治疗潜力：证明了这一新策略在1型糖尿病、自身免疫性肝炎和多发性硬化症模型中的有效性，展示了其广阔的临床应用前景。三、核心研究内容深度解析 3.1 发现一：LAG-3的抑制功能依赖于其与TCR的“空间邻近” 传统观点认为，抑制性受体的功能主要由其与配体的结合直接触发。然而，本研究的第一个重大发现是，对于LAG-3而言，情况并非如此简单。研究团队首先构建了一个“简化系统”，即利用不表达天然MHC-II的人工抗原提呈细胞（aAPC）。他们发现，当这些aAPC只表达能够结合LAG-3但不能识别TCR的“非同源”MHC-II分子时，即使LAG-3与MHC-II成功结合，也无法有效抑制T细胞的活化。相反，只有当aAPC表达能够同时被TCR和LAG-3识别的“同源”肽-MHC-II复合物时，LAG-3才表现出强大的抑制功能。这一现象引出了一个大胆的假设：MHC-II分子可能不仅仅是LAG-3的配体，更像一个“桥梁”，其关键作用是将在细胞膜上原本分离的LAG-3和TCR拉到一起。只有当LAG-3与TCR在空间上足够“邻近”时，它的抑制“刹车”才能被踩下。图 1. LAG-3 在同源 pMHC II 存在时介导 CD4+ T 细胞抑制 A. B 细胞与 CD4+ T 细胞界面的配体-受体互作示意图 B. 经 mock 或小鼠 LAG-3 转导的 DO11.10 T 细胞与负载 OVA323-339 同源肽的 LK35.2 B 细胞共培养后的 IL-2 产量（n=3） C. 表达同源 pMHC II 的 aAPC 与 LAG-3+ T 细胞界面互作示意图 D-E. 小鼠 LAG-3 CAR Jurkat NF-κB-GFP 报告 T 细胞与 mock 或 I-Aᵈ OVA323-339 aAPC 共培养的代表性图像及 GFP 信号定量 F-G. 经 mock 或小鼠 LAG-3 转导的 DO11.10 T 细胞被同源 I-Aᵈ OVA323-339 aAPC 激活后的 IL-2 产量及 LAG-3 抑制率（n=3） H-M. 人 LAG-3 CAR 与 mock 或 HLA-DR1 HA306-318 aAPC 共培养的代表性图像及 GFP 信号定量（n=3） N-O. 经 mock 或人 LAG-3 转导、携带 HA1.7 TCR 的 Jurkat NFAT-GFP 报告 T 细胞被 HLA-DR1 HA306-318 aAPC 激活后的 GFP 阳性细胞百分比及 LAG-3 抑制率（n=4）为了直接验证这一“空间邻近假说”，研究团队设计了一个极为精妙的实验。他们利用一种化学诱导的异源二聚化系统（rapalog系统），在该系统中，可以通过加入一种小分子药物（rapalog）来强制细胞膜上的两种不同蛋白物理性地靠近。他们将TCR的激活分子（抗CD3抗体）与FRB蛋白融合，将非同源MHC-II分子与FKBP12蛋白融合。在没有rapalog时，TCR和LAG-3（通过非同源MHC-II结合）是分离的；而加入rapalog后，FRB和FKBP12结合，从而强制性地将TCR和LAG-3拉到了一起。结果惊人地清晰：在加入rapalog后，即便没有同源MHC-II的参与，T细胞的活化也受到了显著抑制。这一实验无可辩驳地证明了，LAG-3的抑制功能并不绝对依赖于特定的配体信号，而是由其与TCR的物理邻近性所“授权”的。这是一个全新的、以空间构象为核心的免疫调控模型。图 2. TCR 空间邻近性对 MHC II/LAG-3 介导的 CD4+ T 细胞抑制至关重要 A. 表达膜锚定抗小鼠 CD3（anti-CD3MT）和非同源 pMHC II（pMHC class IINC）的 aAPC 设计示意图，用于解耦 MHC II 类分子与 CD4+ T 细胞 TCR 的相互作用 B. 流式细胞术检测三种 aAPC 克隆的 anti-CD3MT 表达水平（相对于亲本细胞的 MFI） C-D. 小鼠 LAG-3+ 3A9 T 细胞被上述 aAPC 克隆激活后的 IL-2 产量，有无非同源 I-Aᵇ OVA323-339 的瞬时过表达 E-H. 涉及 anti-CD3MT aAPC 的 IL-2 产量及抑制率分析，包括有无非同源 pMHC II、mock 与 LAG-3 转导的 3A9 T 细胞对比、同型对照与抗 LAG-3（M8）处理对比 I-K. rapalog 诱导异源二聚体实验的示意图、构建设计及流式细胞术检测标记表达（相对于亲本细胞的 MFI） L-N. mock 或小鼠 LAG-3 转导的 3A9 或 DO11.10 T 细胞被表达 rapalog 诱导异源二聚体的 aAPC 激活后的 IL-2 抑制率 3.2 发现二：深入分子内部——LAG-3如何通过破坏“信号凝聚体”来“釜底抽薪” 既然空间邻近是关键，那么下一个问题是：当LAG-3被拉到TCR旁边后，细胞内部究竟发生了什么？为了回答这个问题，研究团队将目光投向了细胞内信号转导的最前沿——生物分子凝聚体（Biomolecular Condensates）。 LAG-3的胞内域（ICD）可以直接与TCR复合物的关键组分CD3ε相互作用。当LAG-3的ICD被强制带到TCR附近时，它会竞争性地结合CD3e，从而破坏CD3ε与激酶Lck的结合，导致这个至关重要的“信号凝聚体”无法有效形成或维持稳定。 Lck是启动TCR下游信号瀑布的“第一把钥匙”，Lck与CD3ε的分离，相当于直接切断了信号的源头，导致T细胞活化被有效终止。为了进一步精确定位LAG-3 ICD中的功能区域，研究团队进行了一系列突变分析。结果显示，LAG-3 ICD中两个保守的基序——FSAL基序和EP基序——对于破坏CD3ε/Lck凝聚体以及发挥抑制功能至关重要，而另一个已知的KIEELE基序在此过程中的作用相对较弱。这与以往研究中关于这些基序功能重要性的争论提供了新的见解。下表总结了关键的突变分析结果：突变体突变对象关键区域/基序对CD3ε/Lck凝聚体的影响 T细胞抑制功能影响推断作用 F483A/L486A LAG-3 FSAL Motif 破坏作用丧失显著减弱直接参与或稳定与CD3ε的相互作用 ΔEP LAG-3 EP Motif 破坏作用部分减弱部分减弱可能通过静电作用协同FSAL基序发挥功能 ΔKIEELE LAG-3 KIEELE Motif 影响较弱影响较弱在此邻近模型中的作用非主导 CD3ε BRS基序突变 CD3ε Basic Rich Sequence (BRS) 与LAG-3凝聚能力丧失 - CD3ε上与LAG-3和Lck结合的关键位点 CD3ε mPRS CD3ε Proline Rich Sequence (PRS) 未提及对凝聚体影响（实验显示不影响与LAG-3的凝聚体形成） - 非LAG-3与CD3ε结合及破坏CD3ε/Lck凝聚体的关键区域 CD3ε mRK CD3ε RK Motif 未提及对凝聚体影响（实验显示不影响与LAG-3的凝聚体形成） - 非LAG-3与CD3ε结合及破坏CD3ε/Lck凝聚体的关键区域 LAG-3 F475A/L478A LAG-3 类似FSAL基序区域（与F483A/L486A类似位置突变）未明确提及（推测类似F483A/L486A突变体影响）未明确提及（推测抑制功能减弱）可能与FSAL基序功能相似，参与与CD3ε的相互作用这些发现共同揭示了一个精巧的分子机制：LAG-3通过物理邻近，直接干预TCR信号凝聚体的形成，从源头上关闭了T细胞的活化开关。图 3. LAG-3 胞内域破坏 CD3ε/Lck 凝聚体 A-F. 溶液中 100 μM 人 CD3ε 与 LAG-3 ICD 的凝聚体形成实验，展示野生型或磷酸化状态的 CD3ε 及野生型或 F483A/L486A 突变的 LAG-3（n=5） G-O. 支持脂质双层（SLB）上 5 μM 磷酸化 CD3ε 与 Lck（开放形式 K273R/Y505F 突变或截短型 LckUD-SH3-SH2）的凝聚体形成实验，有无 5 μM 人或小鼠 LAG-3 ICD 及其他抑制性受体 ICD（n=5/6） P-S. 流式细胞术验证 mock 或人 / 小鼠 LAG-3（野生型或突变体）转导的 Jurkat NFAT-GFP 报告 T 细胞或 3A9 T 细胞中 LAG-3 的表达及抑制功能 3.3 发现三：从机制到疗法——“强制邻近”催生新型激动型双特异性抗体BiTS 这项研究最激动人心的部分在于，它没有停留在基础机制的发现，而是迅速将这一新知识转化为了创新的治疗策略。既然“强制邻近”是激活LAG-3抑制功能的关键，那么是否可以设计一种药物来主动实现这一点呢？答案是肯定的。研究团队为此设计了一种双特异性抗体（Bispecific Antibody, BsAb）。一个“手臂”：靶向并结合T细胞表面的LAG-3分子。另一个“手臂”：靶向并结合同一T细胞表面的TCR复合物。通过这种设计，BiTS分子就像一根强有力的“分子绳索”，将LAG-3和TCR强行“捆绑”在一起，人为地创造并稳定了发挥抑制功能所必需的“空间邻近”状态。为了避免在体内引发不必要的免疫反应（如抗体依赖的细胞毒性作用，ADCC），研究人员还对其Fc片段进行了N297G突变改造，使其成为一种“功能沉默”的抗体。体外实验结果证实了这一设计的有效性：BiTS能够以剂量依赖的方式，强效抑制CD4$^{+}$和CD8$^{+}$ T细胞的活化。重要的是，这种抑制作用是严格依赖于LAG-3的——当作用于不表达LAG-3的T细胞时，BiTS的抑制效果大幅减弱，证明其功能确实是通过激活LAG-3通路实现的。图 4. LAG-3/TCR 双特异性抗体（BiTS）介导 LAG-3 依赖性 T 细胞抑制 A. LAG-3/TCR BiTS 设计及 LAG-3 结合破坏的 BiTS 突变体（BiTSmut）示意图 B. 流式细胞术检测 100 nM BiTS 和 BiTSmut 与 TCR+LAG-3+ 细胞、TCR+LAG-3- 或 TCR-LAG-3+ B3Z 细胞的结合 C. mock 或 LAG-3 转导的 CD4+ TCR+（3A9）或 CD8+ TCR+（B3Z）T 细胞被 anti-CD3MT aAPC 激活后，在有无 10 nM BiTS、BiTSmut 或同型对照存在下的 IL-2 产量（n=3） D-E. 不同浓度 BiTS 或 BiTSmut 对 IL-2 产量的抑制作用及半最大抑制浓度（IC50）（n=3）图 5. LAG-3/TCR BiTS 强效抑制抗原特异性 CD4+ 和 CD8+ T 细胞反应 A. CD4+ TCR+（3A9）或 CD8+ TCR+（B3Z）T 细胞分别被 I-Aᵏ HEL50-62 CD86+ aAPC 或负载 OVA257-264 的 mutuDC 激活后，在 10 nM BiTS、BiTSmut 或同型对照存在下的 IL-2 产量（n=3） B-D. BiTS、BiTSmut 或 Ly-TCR（无 LAG-3 臂）对 mock 或小鼠 LAG-3 转导的 CD4+ TCR+（3A9）或 CD8+ TCR+（B3Z）T 细胞 IL-2 产量的抑制作用及 IC50（n=3） 3.4 深度对比：BiTS vs. Relatlimab——同一靶点，两种截然相反的疗法 BiTS的出现，使得LAG-3这个靶点呈现出一种迷人的“双重人格”。为了更好地理解BiTS的创新性，有必要将其与已上市的LAG-3靶向药物——Relatlimab——进行对比。 Relatlimab是百时美施贵宝（BMS）开发的全球首个获批的LAG-3抑制剂，它与PD-1抑制剂Nivolumab组成的复方制剂（商品名Opdualag）已被批准用于治疗黑色素瘤。Relatlimab是一种拮抗型（Antagonist）单克隆抗体，其作用机制是阻断LAG-3与其配体（如MHC-II）的结合。在癌症治疗中，肿瘤细胞利用LAG-3通路来抑制T细胞的抗肿瘤活性；而Relatlimab通过切断这条通路，相当于“松开刹车”，重新释放T细胞的杀伤力，从而达到治疗癌症的目的。而本研究中的BiTS则恰恰相反，它是一种激动型（Agonist）双特异性抗体。它的目标不是“松开刹车”，而是“踩死刹车”。在自身免疫病中，T细胞的过度活化是致病根源，因此需要抑制而非激活它们。BiTS通过强制LAG-3与TCR邻近，主动激活LAG-3的抑制信号，从而精准地“沉默”致病T细胞。下表清晰地对比了这两种基于同一靶点的、截然不同的治疗策略：特性 BiTS（本文研究） Relatlimab（已上市抗癌药）抗体类型双特异性激动型抗体 (Bispecific Agonist) 单克隆拮抗型抗体 (Monoclonal Antagonist) 作用机制强制LAG-3与TCR邻近，激活抑制信号阻断LAG-3与配体结合，解除抑制信号对T细胞功能的影响抑制 (Suppression) 激活 (Activation) 治疗领域自身免疫病 (Autoimmune Diseases) 癌症 (Cancer) 核心科学原理空间邻近诱导信号调控配体-受体阻断这种“一靶两用”的现象，深刻揭示了对靶点生物学机制的深入理解，是如何催生出功能完全相反但同样具有巨大潜力的创新疗法的。 3.5 发现四：BiTS在多种自身免疫病模型中展现强大治疗潜力基础机制的阐明和创新分子的设计最终都需要在活体模型中得到验证。研究团队在多种经典的自身免疫病小鼠模型中评估了BiTS的治疗效果，结果令人振奋： 1型糖尿病模型（RIP-OVA模型）：这是一种由CD8$^{+}$ T细胞攻击胰岛β细胞导致的疾病模型。结果显示，与对照组相比，BiTS治疗显著延缓了糖尿病的发生，并有效保护了小鼠免于发病。组织学分析也证实，BiTS治疗组小鼠胰岛的T细胞浸润（胰岛炎）程度显著降低。自身免疫性肝炎模型：这是一种由记忆性CD8$^{+}$ T细胞驱动的肝脏炎症模型。BiTS治疗极大地减轻了肝脏的炎症损伤和CD8$^{+}$ T细胞浸润。单细胞测序分析进一步揭示，BiTS不仅减少了致病性T细胞的数量，还深刻改变了它们的活化状态和功能表型。多发性硬化症模型（EAE模型）：这是一种主要由CD4$^{+}$ T细胞介导的中枢神经系统自身免疫病模型。无论是在疾病发生前的预防性治疗，还是在疾病高峰期的治疗性给药，BiTS均能有效降低疾病的临床评分，改善小鼠的神经功能症状。这些在不同疾病背景、由不同T细胞亚群（CD4$^{+}$或CD8$^{+}$）驱动的模型中取得的一致性阳性结果，强有力地证明了BiTS作为一种平台型疗法的巨大潜力，有望用于治疗多种T细胞介导的自身免疫性疾病。图 6. LAG-3/TCR BiTS 抑制 CD8+ T 细胞活化并预防糖尿病 A-C. WT 或 Lag3-/- OT-I T 细胞被负载 OVA257-264 肽的 mutuDC 激活后，在 10 nM 同型对照、BiTSmut 或 BiTS 存在下的流式细胞术点图及 IL-2/IFN-γ 产量（n=3） D-E. RIP-OVA 糖尿病模型示意图及糖尿病发病率（每组 n=8，采用 Kaplan-Meier 检验） F-G. 糖尿病小鼠胰岛的代表性组织学图像（无胰岛炎、peri - 胰岛炎、胰岛炎）及组织学评分（每组分析 >10 个胰岛）图 7. LAG-3/TCR BiTS 改善 CD8+ T 细胞介导的肝炎 A-B. IND-PALF 患者与 Dx-PALF 患者肝组织中免疫相关基因的 RNA-seq 分析及 GO 富集分析 C-D. 抗 - 4-1BB 处理后肝炎小鼠的肝损伤指标（ALT）及肝内 T 细胞亚群分析（n=4-9/5） E-I. 肝炎小鼠肝内免疫细胞的单细胞 RNA-seq 分析，包括 UMAP 降维、细胞类型鉴定及 CD8+ T 细胞亚群的效应 / 记忆基因特征评分 J-O. 肝内 CD8+ T 细胞与髓系细胞的配体 - 受体互作分析及炎症因子水平检测（n=5）五、关键结论与批判性总结 5.1 本文关键结论本研究系统性地揭示了免疫检查点LAG-3的一个全新且精密的调控机制，并基于此开发了一种极具潜力的自身免疫病新疗法。其核心结论如下：机制重定义：LAG-3的抑制功能并非简单地由配体结合触发，而是“有条件的”，其高效发挥作用的前提是与TCR在细胞膜上形成空间邻近。分子通路阐明：在空间邻近的条件下，LAG-3的胞内结构域（ICD）通过与CD3ε直接相互作用，破坏了TCR活化所必需的CD3ε/Lck信号凝聚体，从而“釜底抽薪”式地终止了T细胞活化。创新疗法开发：基于“强制邻近”原理，研究团队设计了激动型双特异性抗体BiTS，它能将LAG-3和TCR强行拉近，从而高效、精准地抑制T细胞功能。广谱潜力验证：BiTS在1型糖尿病、自身免疫性肝炎和多发性硬化症等多种动物模型中均展现出强大的治疗效果，证明了其作为一种平台型疗法治疗T细胞介导的自身免疫病的广阔前景。 5.2 专家评述与展望这项工作无疑是免疫学和药物研发领域的一项里程碑式研究，其意义深远，不仅重塑了我们对一个重要免疫检查点的认知，更开辟了一条全新的治疗途径。意义与优势 LAG-3生物学的范式转移：该研究将我们对LAG-3的理解从一个简单的“配体-受体”模型，提升到了一个复杂的、依赖于“空间构象和信号组织”的全新层面。这种“条件性刹车”机制或许可以解释一个长期存在的现象：为何相比于PD-1，LAG-3在生理条件下的抑制功能显得更为温和。这可能是一种进化上的安全设计，通过增加激活门槛，避免在不适当的情况下过度抑制T细胞，从而为免疫系统提供了更精细的调控层次。开创“邻近诱导信号调控”新药模式：BiTS的设计理念极具开创性。在药物研发领域，利用小分子诱导蛋白邻近以降解靶蛋白的PROTACs和分子胶技术已是热点。而BiTS则将这一“邻近诱导”概念从“降解”扩展到了“信号调控”领域，代表了一类全新的治疗模式—— 邻近诱导型生物大分子（Proximity-Inducing Biologics）。这为未来针对其他受体对的信号调控药物开发提供了宝贵的范例和理论基础。严谨优雅的实验设计：从构建简化的人工细胞系统，到利用化学诱导工具精准验证核心假说，再到体外凝聚体实验和多种动物模型的验证，整个研究逻辑链条清晰、证据确凿，体现了极高的科学严谨性和创新性。局限性与未来方向尽管这项研究取得了重大突破，但从实验室走向临床，仍有诸多挑战需要克服，同时也为未来的研究指明了方向。临床转化的挑战：双特异性抗体的开发壁垒：作为一种复杂的生物大分子，双特异性抗体的生产工艺（CMC）复杂、成本高昂。此外，其独特的结构可能带来不可预测的免疫原性（即诱发抗药抗体），以及独特的毒性谱，如可能引发细胞因子释放综合征（CRS）或神经毒性，这些都是临床开发中必须密切关注和解决的问题。患者选择生物标志物的缺失：这是BiTS未来临床成功的关键。自身免疫病具有高度异质性，并非所有患者都适合BiTS治疗。未来的临床试验必须建立一套精准的生物标志物（Biomarker）策略来筛选最可能获益的患者群体。基于本研究的机制，潜在的生物标志物可能包括：致病T细胞的LAG-3表达水平：只有当致病T细胞高表达LAG-3时，BiTS才能有效发挥作用9。 TCR克隆型与疾病驱动因素：识别出由特定T细胞克隆驱动疾病的患者亚群。基线信号通路状态：评估患者T细胞内源性TCR信号通路的活化状态，可能有助于预测其对BiTS的敏感性。开发有效的生物标志物是实现精准医疗、提高T细胞疗法成功率的核心0。在难治性疾病中的定位：对于那些对现有多种疗法（如TNF-α抑制剂、JAK抑制剂等）均无反应的“难治性类风湿关节炎”（D2T RA）患者，他们往往已经耗尽了标准治疗方案。BiTS这种全新机制的疗法，可能为这部分具有巨大未满足医疗需求的患者带来新的希望。未来研究方向：机制的进一步深化：LAG-3的胞内域是否还有其他未知的结合蛋白？它是否会影响除Lck之外的其他激酶？这些问题值得进一步探索。 “邻近诱导”概念的拓展：是否可以将这一设计理念应用于其他共刺激或共抑制受体对，开发出更多用于“打开”或“关闭”免疫反应的工具？小分子药物的探索：是否有可能开发出能够模拟BiTS功能的小分子“分子胶”，通过口服给药，实现更便捷的治疗？总而言之，这项研究不仅为我们解锁了免疫检查点LAG-3的深层奥秘，更重要的是，它将深刻的机理洞察转化为一种极具前景的创新疗法。BiTS的成功开发，为攻克T细胞介导的自身免疫性疾病这一顽疾点亮了一盏新的明灯，也为整个药物研发领域带来了关于“空间邻近性”的宝贵启示。

Field Knowledge · 2025-07-01

Doxorubicin Nuclear Entry Mechanisms: A Comprehensive Review

阿霉素进核机制综述阿霉素自由状态的核转运机制穿膜与胞质分布：*阿霉素（DOX）是一种小分子蒽环类抗癌药物（分子量约543 Da），可以通过被动扩散跨越质膜进入细胞。其两亲性（pH 7.4时对数D值约2.4）使其易于溶解于膜脂质层并穿过细胞膜。早在1985年就有研究表明，蒽环药物主要以被动扩散方式进入细胞，这对药物耐受有重要影响。进入胞质后，游离DOX可在胞质中自由扩散，但因其带正电的性质（pKa≈8.2），在酸性细胞器（如溶酶体）中易被质子化并滞留。这意味着部分DOX可能被*内吞体/溶酶体隔离，减少进入细胞核的有效浓度。研究显示DOX会在酸性晚期内体和溶酶体中蓄积。因此，提高内体/溶酶体pH值可增加DOX在细胞内的游离量；例如，添加质子泵抑制剂能提升内体pH，从而增强DOX的核内分布和抗肿瘤效力。与核孔的相互作用：*由于DOX分子相对较小，它可以在不存在主动运输信号的情况下通过核孔复合体(NPC)的选择性屏障*被动扩散进入细胞核。NPC由多种核孔蛋白（nucleoporins）构成，在核膜上形成通道结构。NPC的亲水通道充满了FG重复序列的核孔蛋白，形成一个允许小分子自由通过而限制大分子扩散的选择性屏障。一般而言，<~40 kDa的分子可通过NPC自由扩散。DOX的分子量远低于这一阈值，因此无需借助主动核进口受体即可进入细胞核。换言之，DOX不含经典核定位序列(NLS)，其进核主要依赖浓度驱动的被动扩散。不过，核孔的通透性也受细胞状态调控：核骨架/核膜结构会影响NPC的开放程度。例如，有研究表明细胞骨架与核骨架的力学联系可调节DOX进入细胞核的通量。当细胞通过外界作用使核纤维和细胞骨架瞬时松弛时，NPC对DOX的通透性增加，核内DOX流入加快；而细胞在软基质上长期培养导致机械张力降低时，核对DOX的通透性下降。由此可见，NPC并非静止通道，其通透性会因细胞机械环境变化而改变。膜转运载体的作用：*除了被动扩散外，某些载体蛋白介导的过程也能影响DOX进入细胞的效率。一些溶质转运蛋白被鉴定为DOX的摄取通道。例如，有机阳离子转运蛋白SLC22A16被证明可介导癌细胞对DOX的主动摄取。在表达SLC22A16的Xenopus卵母细胞中，DOX的摄入呈现可饱和的动力学特征（K_m约5.2 μM）。过表达SLC22A16能增强白血病细胞对DOX的敏感性，说明该转运蛋白增加了细胞内累积的DOX水平。同样，有机阴离子转运多肽OATP1A2（SLCO1A2）也被报道可以转运DOX进入细胞（相反，OATP1B1/1B3对DOX摄取的贡献很小）。这些载体在某些组织或癌细胞中高表达，如SLC22A16在急性白血病和部分实体瘤中过度表达，OATP1A2在肝脏、肿瘤血管等部位存在。有研究发现，在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中，SLC22A16基因缺失与化疗（包括DOX）疗效降低相关，提示缺乏该转运体会削弱DOX对肿瘤的作用。因此，在自然状态下，**膜转运蛋白的表达差异**会导致不同细胞摄取DOX的能力不同：转运体丰富的细胞可主动摄入更多DOX，而缺乏这些载体的细胞主要依赖缓慢的被动扩散。需要注意的是，与摄入方向相反的是*外排转运蛋白（如ATP结合盒(ABC)家族）会将DOX泵出胞外，其中多药耐药泵P-糖蛋白(P-gp/MDR1)对DOX的外排尤为重要。P-gp广泛存在于肿瘤细胞膜和正常组织的屏障细胞中，能主动将DOX泵出细胞，从而降低胞内有效浓度。在P-gp高表达的耐药癌细胞中，DOX的累积量仅相当于野生型敏感细胞的20%左右，进入细胞核的净通量也降低近一半。加入P-gp抑制剂（如维拉帕米、环孢素A或PSC833）可将耐药细胞中DOX的积累提高到敏感细胞的70-80%，同时部分恢复其对药物的敏感性。因此，DOX在未经修饰状态下进入细胞核的效率取决于被动扩散、载体摄取和外排泵三者的净效应。载药系统对DOX核转运路径的影响为了提高DOX在肿瘤细胞核内的富集、减少对正常组织的毒性，研究者开发了多种药物递送系统（如脂质体、聚合物纳米粒等）。这些载药系统可以显著改变DOX进入细胞和细胞核的途径。总体而言，纳米载体通过内吞途径进入细胞，然后在细胞内释放DOX，从而实现与游离DOX不同的分布动力学。下面按不同载体类型进行讨论：脂质体与纳米粒载体：*脂质体是最成熟的DOX载药系统之一，典型产品如Doxil（长循环PEG化脂质体DOX）。与游离DOX直接透膜不同，脂质体携带的DOX通常通过*胞吞作用进入肿瘤细胞。PEG化脂质体在血流中长循环并富集于肿瘤组织（EPR效应），进入肿瘤后被肿瘤细胞内吞，随后在内体/溶酶体内释放DOX。pH响应型脂质体通过设计在酸性环境（如内体pH≈5-6）下膜结构不稳定，从而更快速释放DOX。一项研究比较了酸敏脂质体(SpHL-DOX)与非酸敏脂质体(nSpHL-DOX)在HeLa细胞中的行为：结果发现，SpHL-DOX进入细胞的速度更快，能够更迅速地在内吞途径中释放DOX，并在细胞核内产生更强的药物累积。SpHL-DOX更高的核累积量引发了更显著的细胞凋亡（如激活caspase-3），而非酸敏脂质体则由于释放缓慢，核内DOX水平较低。此外，加入氯喹或蛋白酶体抑制剂E64d以干预溶酶体功能，可进一步增强酸敏脂质体的细胞毒作用，表明加速内吞体逃逸能提高DOX进入细胞核的效率。与之相反，游离DOX由于无需内吞即可扩散进入细胞，通常在更短时间内达到细胞核。实验显示游离DOX处理6小时内就大量出现在细胞核中（符合其被动扩散机制）。但游离DOX也更易被外排泵清除，缺乏肿瘤选择性。相比之下，脂质体等纳米载体通过尺寸排除效应可以一定程度上规避P-gp的作用（P-gp对300–2000 Da的小分子作用显著，对纳米颗粒不能直接泵出）。有报道指出，脂质体包封可逆转部分耐药性：一方面脂质体使DOX隔离于细胞外，P-gp无法立即作用；另一方面脂质体与P-gp的相互作用可能抑制其泵出功能。因此，脂质体载体不仅提高了肿瘤组织中的药物递送，还通过改变入胞路径而在细胞内提高核输送效率。聚合物纳米粒与杂化载体：*聚合物胶束、聚合物-脂质杂化纳米粒等载体同样通过*内吞作用进入细胞，并通过促内体逃逸等机制将DOX释放到胞质，从而增强调入细胞核的药物量。例如，一种聚合物-脂质杂化纳米粒(PLN)将DOX与阴离子聚合物复合后包裹。研究发现，在P-gp过表达的耐药乳腺癌细胞中，DOX-PLN处理可显著提高细胞内DOX的摄入量和滞留时间，远超游离DOX。荧光成像显示，经过DOX-PLN递送，更多药物进入细胞核，并且载体的脂质成分也进入了细胞。内吞途径抑制实验进一步揭示，巨胞饮/吞噬作用是这些纳米粒进入细胞的主要方式。机制上，这种纳米载体通过内吞绕过了细胞膜上P-gp的直接外排，部分DOX伴随载体一起被内吞，躲过了P-gp泵出，然后在细胞内释放并保持更高的滞留。因此，该策略使耐药细胞内的DOX净累积增加，从而克服了一定程度的耐药性。另一项研究将DOX通过共价键偶联到大分子上形成聚合物药物偶联物，如TAT-PEG-多肽-DOX自组装纳米粒（150 nm左右）。HCT8/ADR耐药结肠癌细胞经这种纳米药物处理后，细胞内DOX摄取显著增加，并绕过P-gp介导的外排，细胞内药物保留时间延长。更重要的是，该纳米药物增强了药物在细胞核的分布，在细胞核内累积更多DOX，强烈抑制了DNA/RNA合成。体内实验也表明此纳米制剂对耐药肿瘤有更好的抑瘤效果。总的来说，聚合物纳米载体通过尺寸效应和亚细胞分布差异，使DOX在癌细胞内（特别是细胞核内）的有效浓度提高，减少了多药泵的影响。核定位和靶向递送：*一些载体通过*添加核定位序列(NLS)或其他靶向配体来专门增强DOX的核转运。NLS是富含碱性氨基酸的短肽序列，能够被核输入蛋白(importin α/β)识别并将其携带的货物运入细胞核。尽管DOX本身无NLS，但研究人员将NLS肽偶联到纳米颗粒表面或与DOX结合，从而借助细胞自身的核进口机制提高DOX进核效率。Misra等制备了NLS修饰的PLGA纳米粒载DOX（粒径约226 nm），在乳腺癌MCF-7细胞中显示出显著增强的核靶向输送：与未修饰纳米粒或游离DOX相比，NLS-纳米粒处理使更多DOX进入细胞核，细胞毒性大幅提高（MTT测得IC_50下降，以游离DOX的17.6 μM降至2.3 μM）。共聚焦显微镜观察也证实，NLS修饰纳米粒使DOX在细胞核的定位明显增加。同样，将HIV-TAT等穿膜/核导向肽与DOX或载体结合也是有效策略。Pan等的研究将DOX与TAT-PEG-多肽组装成纳米颗粒，发现其细胞摄取率更高且核内药物分布显著加强，能够克服结肠癌耐药细胞的P-gp介导耐药。此外，配体靶向也是改变DOX分布的途径之一。例如，将DOX与铁转运蛋白转铁蛋白(Tf)*偶联可利用癌细胞过度表达的Tf受体(TfR/CD71)进行靶向递送。TfR在多种肿瘤（如乳腺癌）中表达上调，在正常细胞中相对较低。Relecka等的研究表明，DOX–Tf偶联物选择性地增加了乳腺癌细胞内的DOX累积，同时对正常内皮细胞的毒性显著降低：与游离DOX相比，DOX–Tf使正常内皮细胞的存活率提高了3.5倍，而在癌细胞中毒性更强。这说明靶向配体介导的递送既*增强了肿瘤细胞对DOX的核内积累，又减少了正常细胞的摄取，体现出对肿瘤的选择性。总之，各类载药系统通过改变细胞摄取途径（如利用受体介导胞吞代替被动扩散）以及促进核靶向，提高了DOX在肿瘤细胞核内的浓度。从分子机制上看，载药系统为DOX打开了新的“进核通路”：内吞途径使其绕过了质膜外排泵、靶向序列使其借用了细胞主动核进口机制。这些设计均旨在提高DOX对肿瘤细胞核的有效打击，同时降低对正常细胞核的毒副作用。肿瘤细胞与正常细胞机制差异 DOX进核机制在不同类型细胞间可能存在显著差异。癌细胞与正常细胞在膜转运蛋白表达、能量代谢、核膜结构及细胞周期状态等方面的不同，都会影响DOX的入核效率：膜转运与耐药相关差异：*癌细胞常出现膜运输蛋白表达重编程。例如，某些肿瘤高表达DOX摄取载体（如SLC22A16、OATP1A2），这可能使DOX更易进入这些细胞的胞质和细胞核。相反，有些正常组织细胞可能几乎不表达这些载体，主要依靠缓慢的被动扩散来吸收DOX。**外排泵P-gp**在未经药物压力的正常细胞中表达通常较低，而许多经历过化疗选择压力的肿瘤细胞会过度表达P-gp等MDR蛋白。这意味着在相同浓度下，耐药肿瘤细胞往往将大部分DOX泵出，核内累积浓度偏低；而正常细胞由于缺乏高效泵出，反而可能在核内积累较高DOX水平并发生毒性（典型例子是心肌细胞累积DOX导致心脏毒性）。Shen等比较了P-gp过表达的耐药癌细胞与其亲代敏感细胞中的DOX分布，发现耐药细胞核内DOX含量不到敏感细胞的一半。临床上，人们尝试通过*联合P-gp抑制剂或使用非P-gp底物型载药系统来提高癌细胞核内DOX水平，同时希望正常组织因P-gp低而不至于过度蓄积药物。能量依赖性与代谢差异: 游离DOX主要通过被动过程进出细胞，不直接消耗细胞能量；而载药纳米系统进入细胞常需要能量驱动的内吞。因此，细胞代谢水平的差异会影响DOX的入核效率。肿瘤细胞通常具有活跃的代谢和内吞活动，可加速对纳米药物的摄取；相反，某些正常分化细胞（如静止期细胞）代谢率低，内吞途径不活跃，对载药系统的摄入效率较低。实验上，在4℃低温或存在ATP生成抑制剂（如叠氮化钠）时，内吞作用会被抑制，载药DOX进入细胞核的路径几乎被切断，而游离DOX的被动扩散则受温度影响较小（但膜流动性降低仍会减缓扩散）。Wong等的研究用吞噬抑制剂处理细胞，观察到纳米载DOX的内吞被阻断，核内荧光显著下降。这类能量依赖性的验证说明：肿瘤细胞高度活跃的摄取途径对载药DOX核转运至关重要，而在低代谢状态下（如正常细胞或低温条件），这些途径受限导致核内药物减少。核膜结构与细胞力学差异：*癌细胞的核骨架组成和核孔功能常与正常细胞不同。许多癌细胞下调Lamin A/C等核纤层蛋白，使细胞核更加柔软、变形性更强，以利于侵袭和增殖。这种核结构变化可能影响NPC的密度和通透性。**核孔复合体数量**在不同细胞中的密度也不同：增殖活跃的细胞通常拥有更多的NPC以满足大量核质交换的需求。侵袭性强的癌细胞系中，提取的裸露细胞核对DOX的通透性彼此存在差异；一般来说，恶性程度高的细胞核膜可能更“漏”，允许DOX更快进入核内。同时，DOX本身对核结构也有影响。一些报道指出DOX处理可导致核膜相关蛋白的变化，如核纤层B1蛋白水平下降，可能使核稳定性降低。核膜的完整性和NPC功能的改变都会反馈影响DOX的核内积累。近期有研究从*力学角度揭示：增强细胞核-细胞骨架的联结（例如培养在硬质基质上）会减少DOX进入细胞核，而短时间内破坏肌动蛋白、微管或核纤层则瞬时提高DOX核内摄取。这提示肿瘤细胞经常具有异常的细胞骨架和核骨架互动（例如许多肿瘤细胞展现核膜不规则、核纤层变薄），从而可能天然更容易让DOX进入细胞核。相反，正常细胞核骨架完整，机械张力维持，NPC或许更严格地控制分子进出。机械性“松弛”可视为一种促进药物核进口的方式：比如使用低剂量紫杉醇预处理肿瘤细胞可“力学诱导”核膜更通透，实验证实这使随后加入的DOX核摄取量显著提高。因此，肿瘤细胞独特的核结构/力学生态（柔软的核、异常的核孔功能等）可能是其DOX进核机制与正常细胞不同的内在原因之一。细胞周期因素：细胞周期影响DOX进核有两个方面：(1) 增殖状态： DOX主要作用于DNA，因此对分裂活跃的细胞毒性更强。S期时细胞核DNA展开供复制，可能增加DOX结合机会；G2/M期时若DOX进入，可干扰有丝分裂。而静止期(G0)细胞核膜稳定、代谢慢，DOX进入和作用都相对减少。(2) 有丝分裂核膜破裂：*在细胞进入有丝分裂时，核膜暂时解体，胞质与染色体无屏障交流。在这一阶段，无需通过NPC，DOX即可直接接触到染色质。对于游离DOX而言，这提供了一个“机会窗口”使其大量结合染色体DNA，从而在分裂后子核中保持高浓度。这部分解释了为何DOX对高速分裂细胞有更强杀伤力。不过对于正常细胞而言，很多处于分化静止状态，不经历频繁的核膜崩解，因此DOX只能通过NPC缓慢进入核内，对这些细胞的影响相对较小（但如心肌等非分裂细胞由于缺乏外排机制，仍可能积累DOX导致慢性毒性）。值得注意的是，一些抗癌新策略正是利用细胞周期差异，如同步化肿瘤细胞于有丝分裂期以增加药物摄入，或将正常细胞停滞于特定周期保护它们避免药物伤害。这些都凸显了*细胞周期对DOX进核效率的影响。总的来说，肿瘤细胞（特别是高度增殖、具耐药表型的）与正常细胞在DOX进核机制上的差异是多因素叠加的结果，包括膜运输体系、能量代谢、核结构和细胞周期等方面。这些差异为我们提供了靶向肿瘤细胞核转运的策略依据，也提醒我们在研究DOX作用时应区分分析细胞种类。下表总结了DOX进入细胞核的不同路径及其涉及的关键蛋白或影响机制： DOX进核路径关键蛋白/机制参考文献被动扩散跨膜 (自由DOX) - 无需载体，依赖浓度梯度；- 质膜脂质相容性（疏水-亲水平衡）；- 分子量小于NPC排除限制，可自由透过核孔复合体。载体介导跨膜 - 摄入载体：SLC22A16、OATP1A2等膜转运蛋白，将DOX主动转运入胞质；- 外排载体：P-gp、MRP等，将DOX泵出胞外，减少净内流。内吞/纳米载体路径 - 胞吞相关：網格蛋白介导内吞、巨胞饮等将载药颗粒吞入；需要ATP能量；- 内体逃逸：pH敏感脂质体膜破裂或聚阳离子破膜，实现DOX从内体/溶酶体释放；- 尺寸效应：纳米粒避免P-gp识别，提高细胞内滞留。 NLS介导核进口 - 核定位序列(NLS)：如经典的质朴霉素序列PKKKRKV，可偶联于DOX或载体；- 核输入蛋白：Importin-α/β识别NLS并穿行NPC运输复合物进入核；- 核孔蛋白：NPC中的FG核孔蛋白与importin相互作用开辟通道。有丝分裂核膜开放 - 核膜消失：细胞进入M期时核膜解体，胞质与核物质混合；- 时机依赖：DOX在此阶段可直接接触染色体，大量嵌入DNA；- 非特异过程：不涉及特定载体蛋白，但仅发生于分裂细胞。（间接体现周期影响）表：阿霉素进入细胞核的主要路径及其关键机制。 DOX进核机制验证的关键实验步骤深入研究和验证上述DOX进核机理，可通过多种细胞和分子实验手段相结合来实现。下面列出若干关键实验设计步骤：实时荧光成像观测DOX定位：利用DOX本身的红色自发荧光或荧光标记的DOX，结合活细胞激光共聚焦显微镜，动态监测DOX从细胞外、胞质到细胞核的时空分布。例如，可在不同时间点拍摄细胞核内DOX荧光积累的图像，以量化进核速度。必要时也可采用高分辨率共聚焦及三维重构，精确定位DOX是弥散在核质中还是结合于染色质。对于超微结构定位，可用电子显微镜（EM）观察经高浓度DOX处理细胞的超薄切片，在细胞核区域辨识具有高电子密度的DOX-DNA复合物沉积。利用共聚焦显微镜实时观测阿霉素（DOX）在细胞中的分布变化。（A）示意图：实验设置用于测量DOX进入细胞核的过程。（B）代表性图像：红色荧光为DOX与细胞核DNA嵌合，显示随时间推移DOX在细胞核内的积累。（C）量化曲线：DOX核荧光强度随时间上升，每条曲线代表单个细胞核。（D）示意图：DOX跨膜和入核过程，包括质膜通透（受MDR影响）和经核孔进入核内。本图由BioRender绘制。干扰核转运相关蛋白：*采用基因敲低或敲除技术（siRNA或CRISPR-Cas9）靶向细胞的核转运机器，验证其对DOX进核的影响。首先，可敲低*核输入受体如importin-β或importin-α亚基，观察游离DOX和NLS修饰DOX输送的核荧光是否有变化。如果DOX主要经被动扩散，则干扰importin可能无明显影响；而对于NLS介导的载药系统，importin缺失应显著降低DOX核进入量。其次，干扰核孔复合体蛋白（如Nup62、Nup98等），破坏NPC选择性屏障，也能提供线索。例如，用siRNA降低关键FG重复核孔蛋白的表达，测定DOX在核/质的分布变化——若DOX被动通透受限于NPC，那么减少FG网架可能增大NPC孔径、提高DOX核内累积。相反，若干扰核孔蛋白导致核屏障功能紊乱，可能出现大分子漏入核，细胞死亡加快等现象，需要结合对照组进行判读。此外，化学抑制剂也可用来瞬时干扰核转运功能，如小分子INI-43抑制importin-β或小麦胚芽凝集素(WGA)封闭核孔，短时间处理细胞并观察DOX荧光变化，以支持基因敲除的结果。通过这些手段确认特定蛋白在DOX核转运中的作用，可进一步佐证相应机制（如验证NLS纳米粒确实经importin通路入核等）。荧光共定位分析：*将DOX的荧光信号与细胞膜、核膜成分进行共定位观察，可直观了解DOX穿膜和入核过程中的空间关系。具体而言，可选用细胞膜荧光探针（如DiI膜染料）以及标记核膜/NPC的抗体（如抗Nup62、抗核孔复合体蛋白的抗体，结合二抗标记染色）进行染色。然后用共聚焦显微镜观察DOX荧光与这些标记的重叠情况。如在早期时间点，DOX荧光与质膜染料局部重叠，提示DOX可能在膜上聚集或通过膜微区进入；与核孔蛋白信号重叠则表明DOX在通过NPC入口处积累。特别对于*载药系统，可标记载体本身（例如在纳米粒上标记一种不同颜色的荧光）并追踪：观察载体荧光先集中于胞质囊泡再逐渐消失、同时DOX荧光转而出现在细胞核的过程。如果将溶酶体标记（LysoTracker绿色）一起观察，可发现DOX载体是否陷于溶酶体，以及加入氯喹等是否促使DOX从这些囊泡释放、进入核内。另外，通过FRET技术（若DOX荧光可以作为给体/受体）也可探测DOX与DNA或膜脂的距离改变，验证DOX是否与核内DNA结合定位。动力学与能量依赖实验：*设计一系列实验以解析DOX进入细胞及细胞核的速度及其对能量的依赖程度。首先，可通过*时间梯度实验获取动力学参数：如将细胞暴露于DOX并在0、5、15、30、60分钟等不同时间点终止处理，立即固定细胞后测量核内DOX荧光强度，绘制时间-浓度曲线，估算半饱和时间t½等。这个实验对比自由DOX与载药DOX的曲线，可揭示载药系统是否加快或延缓了进核。其次，进行低温与代谢抑制实验：分别在37℃常温和4℃低温条件下处理细胞，同时设置加入ATP抑制剂（如叠氮化钠、2-脱氧葡萄糖组合）的一组，比较不同条件下DOX核内累积量。例如，观察到4℃时游离DOX仍有一定核进入（可能只是较慢），而载药DOX几乎无法进入细胞核，则证明载药途径高度依赖能量的主动过程。再如，在有氧和无氧条件下比较DOX分布，可验证线粒体能量对内吞的影响。最后，可加入特定途径的抑制剂鉴别内吞途径：如氯化铵/巴菲洛霉素A抑制溶酶体酸化，或用胰蛋白酶消化膜受体，或用药物抑制微管（秋水仙碱）和微丝（肌动蛋白，辣根硫蛋白）等，分别针对网格蛋白介导、巨吞饮、微管依赖运输等途径。通过这些抑制剂的组合，可以判定哪种内吞途径在载药DOX进核中占主要地位。举例来说，若使用菲利平(抑制小窝介导)显著降低DOX核荧光，而酵母多糖(抑制巨吞)无影响，则说明主要经网格蛋白途径。只有将动力学数据与能量依赖性结合分析，才能全面了解不同体系下DOX进核的限制步骤。正常 vs 肿瘤细胞对比实验：选择代表性的正常细胞系与肿瘤细胞系，在相同条件下比较DOX的核转运效率和机制差异。这可以包括：(1) 定量摄取比较：采用高内涵成像或流式细胞术分别测定正常细胞和癌细胞在给药后一段时间内的核内DOX荧光强度平均值，比较其比例。预期可能看到某些正常细胞核内荧光低于肿瘤细胞（如有外排泵缺失的正常细胞，也可能相反）；(2) 转运蛋白表达分析：通过qPCR或蛋白质印迹检测两类细胞中SLC22A16、OATP1A2、P-gp等相关载体的表达量，与功能结果相关联；(3) 共定位及超微结构对比：*利用上述荧光共定位手段，观察DOX在正常细胞中是否更多滞留于溶酶体（显示与LysoTracker高度重叠）而在肿瘤细胞中更多逃逸进入核。例如，一项针对DOX在肿瘤和正常心内膜细胞中的研究可能发现，肿瘤细胞溶酶体蓄积较少而正常细胞中DOX荧光大部分局限于周边囊泡。这些差异将有助于阐明为什么DOX对某些正常组织毒性大（可能因为缺乏有效外排/酸化机制）而对某些肿瘤反而作用弱（可能因为内吞隔离或外排过强）。(4) **细胞周期与增殖速率**：通过EdU掺入或Ki-67免疫染色确定细胞增殖水平，将其与DOX核摄取量相关联。预期增殖指数高的细胞系（通常肿瘤细胞）对DOX核摄取和损伤更敏感，而静止细胞则抗性更高。综上，通过平行对比实验，可以确认*肿瘤细胞在结构和功能上哪些特征促成了DOX更高的核内累积，从而为有针对性地改进药物递送提供依据（例如，对正常细胞高毒性的原因也可由此找到缓解策略）。综而言之，阿霉素进核机制的研究需要多层次手段验证，从宏观成像到分子干预相结合。通过实时观察、特异干扰和跨细胞种比较等实验，我们能够全面描绘DOX穿膜、入核的路径蓝图，并解释不同类型细胞对这种经典化疗药物截然不同的响应。这不仅加深了对药物作用机理的理解，也将为提高阿霉素疗效、降低副作用的策略（如核靶向递药、克服耐药等）提供科学依据。

Field Knowledge · 2025-06-17

Don't Eat Me vs Eat Me: Cellular Warfare and the Dual Functions of CD47 Peptides

『”别吃我” vs “吃我”』：细胞世界的攻防战，CD47肽的双重妙用本文基本信息标题：Suppressing or Enhancing Macrophage Engulfment through the Use of CD47 and Related Peptides (通过使用CD47及其相关肽抑制或增强巨噬细胞的吞噬作用) 期刊：Bioconjugate Chemistry Citation: Bioconjugate Chem. 2022, 33, 1989-1995 Corresponding Author: Dennis E. Discher Biophysical Engineering Laboratories and Bioengineering Graduate Group, University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania 19104, United States orcid.org/0000-0001-6163-2229; Email: discher@seas.upenn.edu 摘要外来颗粒和微生物在体内会被巨噬细胞迅速清除，尽管许多关键的摄取机制仍不清楚。“自身”细胞表达CD47，它作为巨噬细胞上SIRPα的抗吞噬配体发挥作用，特别是当促吞噬配体（如抗体）同时展示时。在此，我们综述了CD47及相关的“自身”肽作为巨噬细胞摄取的调节剂。与CD47或源自其SIRPα结合位点的肽共轭的纳米颗粒，可以在体外和体内抑制巨噬细胞的吞噬摄取，在展示CD47的病毒上也发现了类似的现象。因此，作为有效载荷的药物、染料和基因对靶细胞的递送效率得以提高。另一方面，癌细胞表达的CD47使其能够逃避巨噬细胞和免疫监视。这推动了针对CD47-SIRPα的可溶性拮抗剂的开发，从临床上的阻断性抗体到临床前模型中的合生肽。因此，**CD47及其肽正在成为具有双重用途的、抗击疾病的吞噬作用调节剂**。 mindmap root(CD47-SIRPα：细胞吞噬的双向调控枢纽) 背景：巨噬细胞的“敌我识别”挑战 **“吃我”信号** 刺激吞噬外来物 **“别吃我”信号** 保护自身细胞 **核心信号轴** CD47「自身ID卡」 - SIRPα「ID阅读器」策略一：抑制吞噬「增强递送」 ::icon(fa fa-paper-plane) **核心思想** 为“友军”穿上“自身”的隐身衣 **应用一：纳米药物** **方法** 将CD47或“自身”肽共轭到纳米颗粒表面 **效果** 延长血液循环时间 增强肿瘤靶向递送 **应用二：病毒载体** **方法** 将CD47整合到慢病毒包膜 将“自身”肽展示在AAV衣壳 **效果** 降低免疫清除 提高基因治疗效率策略二：增强吞噬「癌症免疫治疗」 ::icon(fa fa-crosshairs) **核心思想** 撕掉癌细胞的“ID卡”，使其暴露给免疫系统 **作用机制** 使用可溶性拮抗剂 阻断癌细胞CD47与巨噬细胞SIRPα的结合 **主要方法** **抗体疗法** 针对CD47或SIRPα的单抗 「如Magrolimab」 **重组蛋白** 可溶性CD47/SIRPα作为诱饵 **“纳米自身”肽** 多价肽高效阻断SIRPα **主要挑战** “抗原库”效应导致的在靶脱瘤毒性 「如贫血、血小板减少」结论与展望 **双重用途** 同一靶点，可实现抑制与增强两种相反效果 **未来方向** 优化靶向性，减少副作用 进一步研究促吞噬信号的作用机制引言吞噬作用是一种古老而基础的细胞过程，指的是对一个目标的吞食行为。对于变形虫而言，细菌和真菌是其吞噬的目标，这个过程几乎不需要或完全不需要辨别。然而，在动物体内，诸如巨噬细胞之类的吞噬细胞必须识别、攻击并优先吞噬“异己”目标，同时避免伤害健康的“自身”细胞。这些先天性免疫吞噬细胞是宿主抵御各种大小入侵微生物的第一道防线。吞噬作用由“吃我”信号所激发，这些信号会启动肌动蛋白细胞骨架的重塑，从而驱动巨噬细胞伸出突起以包裹——并随后内化和摧毁——一个“异己”目标。相关的驱动因素范围广泛，从高度特异性的生物分子相互作用物（如蛋白质-蛋白质相互作用），到特异性较低的表面效应物（如电荷、吸附的物质、配体模式），再到物理化学特征（如刚度、形状）。与这些“吃我”通路相对的，是能够抑制巨噬细胞摄取的“别吃我”信号分子。这篇简要综述将聚焦于通过调控特定的“别吃我”信号轴——CD47-SIRPα——来调节巨噬细胞对纳米颗粒、病毒和癌细胞清除方面的最新进展。巨噬细胞检查点，CD47-SIRPα “自身标记”蛋白CD47是一种普遍表达的整合膜蛋白，它通过与巨噬细胞受体SIRPα相互作用来抑制吞噬摄取。尽管CD24与Siglec-10之间的相互作用可能是另一个潜在的巨噬细胞检查点，但CD47-SIRPα相互作用在许多高等动物中的研究更为透彻且更为保守。对巨噬细胞摄取的抑制作用涉及SIRPα胞质区的免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）的磷酸化，并激活磷酸酶SHP-1和SHP-2。 CD47与SIRPα之间的结合相互作用倾向于是物种甚至是品系特异性的，但也存在一些显著的交叉相互作用，例如人的CD47可以与NOD小鼠和猪的SIRPα结合，而猪的CD47也能与人的SIRPα结合。因此，这种受体-配体相互作用的抑制效应是由蛋白质的序列和结构决定的。巨噬细胞高效清除体内循环异物的能力，常常阻碍了基于纳米颗粒的药物递送，无处不在的巨噬细胞的摄取作用使得药物难以到达预期的靶点，例如癌细胞。这催生了利用CD47来使固体颗粒和病毒更具耐受性，并增加纳米药物和基因靶向递送效率的想法。与此相辅相成的一个目标是拮抗CD47-SIRPα轴以增强吞噬作用，其中，基于抗体的阻断正迅速成为癌症免疫疗法中一个具有临床意义的新增手段，而小分子抑制性肽段的设计也带来了新的可能性。 xxxxxxxx 图1：“自身标记”CD47抑制巨噬细胞的吞噬作用血清蛋白，如血液中的IgG抗体，会吸附到“外来”颗粒表面或与之特异性结合，刺激吞噬作用。然而，如果巨噬细胞表面的SIRPα与其配体CD47（表达在包括红细胞在内的“自身”细胞上）结合，这种吞噬摄取就会被抑制。展示CD47和“自身”肽的纳米颗粒通过延迟清除来增强递送静脉注射的纳米颗粒具有在所有组织和病灶部位循环的潜在优势。然而不幸的是，这类被注射的纳米颗粒通常在数分钟到数小时内就被单核吞噬细胞系统（MPS）清除，特别是肝脏和脾脏中的巨噬细胞。作为对比，新鲜的红细胞（RBCs）在输注后可以循环数周甚至更长时间，但最终同样会被巨噬细胞清除，尤其是在脾脏中。巨噬细胞识别并清除一个纳米颗粒的具体机制尚不完全清楚。已知的是，血液中的血清蛋白会物理吸附并积聚在所有表面，形成一个“蛋白质冠”，这个冠可以与吞噬细胞的受体作用。其中最显著的是免疫球蛋白G（IgG），它可以结合并激活巨噬细胞的Fc受体（FcRs）。这个过程通常被称为调理作用（opsonization），它代表了生物材料领域长期以来的描述：纯净的化学物质在体内几乎总会被“污染”。聚乙二醇化（PEGylation）是延长纳米颗粒循环的经典方法，它倾向于延迟蛋白质在表面的物理吸附，但清除过程仅仅是被推迟了。调理作用会导致与巨噬细胞的相互作用，但细胞与材料的相互作用还会受到物理性质的进一步调节，例如刚度、尺寸和曲率（形状），这些都已被证明是影响巨噬细胞清除纳米颗粒的因素。由于巨噬细胞的摄取，纳米颗粒的循环半衰期较短，这一局限性为修饰它们以使其更像“自身”提供了机会（如图2所示）。将CD47的胞外域（约100个氨基酸）通过生物素化连接到涂有抗生物素蛋白的、细胞大小的聚苯乙烯微球上，足以在微球被抗生物素蛋白IgG调理后，抑制其被吞噬。重要的是，CD47对缺少IgG的微球没有影响。微球实验的成功鼓励了后续的纳米微珠研究，并推动了一种相关的、由21个氨基酸组成的“自身”肽的合成。体内测试表明，CD47和“自身”肽都能通过延迟脾脏巨噬细胞的清除，来增加纳米微珠在小鼠体内的循环半衰期，从而极大地增强了肿瘤成像和药物在肿瘤部位的递送效率。随后，一个独立的实验室将“自身”肽连接到氧化石墨烯纳米片上，报告了相似的结果，并得出结论：“自身”肽比PEGylation更有效。其他实验室的研究也表明，用重组CD47或“自身”肽对纳米材料进行功能化，通常能延长循环时间、抑制清除并改善治疗效果。另一项应用将“自身”肽连接到纳米脂质体上，与对照组纳米脂质体不同，研究者发现它们能够饱和并“钝化”肝脏巨噬细胞，从而增加了后续注射的其他纳米颗粒的循环时间和功效。在这些不同的纳米颗粒上，血清中起调理作用的IgG的沉积是否在结果中扮演了角色，通常尚不明确。尽管如此，各项研究都凸显了将CD47或更短的“自身”肽偶联到各种纳米材料上在多种应用中的实用价值。 xxxxxxxxxx 图2：CD47肽延长循环并增加靶向递送载药纳米颗粒（左）和携带基因的慢病毒（右）由于被吞噬细胞摄取，其疗效有限。将CD47及相关的“自身”肽连接到纳米颗粒和病毒表面，它们可以与巨噬细胞上的SIRPα结合，帮助将其识别为“自身”，从而延长循环时间并增强靶向递送。展示“自身”信号的病毒能够抑制吞噬作用并增强基因递送基于病毒的基因递送已广泛用于临床，例如疫苗（如新冠病毒的刺突蛋白）和细胞的离体工程改造（如CAR-T细胞）。在静脉注射以实现靶向基因递送的尝试中，慢病毒（Lentivirus）和腺相关病毒（AAV）载体最为常见，但巨噬细胞同样会被激活以清除这些“天然的纳米颗粒”，这可能导致病毒诱导的炎症反应。许多团队尝试通过偶联合成聚合物来抑制单核吞噬细胞系统（MPS）介导的病毒清除，以期最小化调理作用；然而，这类修饰的空间位阻会妨碍病毒与目标靶点结合所必需的关键蛋白质相互作用。慢病毒通常是在细胞系胞吐后收获的，因此，通过适当改造的细胞系过表达膜蛋白CD47，原则上可以产生展示CD47的慢病毒。已有两项独立研究确实成功生成了CD47-慢病毒，并证实其能减少与巨噬细胞的相互作用并改善基因递送效果。第一项研究用对照组或CD47-慢病毒递送红色荧光蛋白（RFP）到分化的人类巨噬细胞培养物中，结果显示： CD47-慢病毒的转导效率比对照组低约3倍。表达SIRPα的A549肺腺癌细胞优先被CD47-慢病毒转导。（不是抑制吗？）后一个结果表明，SIRPα充当了CD47介导的附着和感染的“停靠受体”。在体内也观察到了相似结果：在A549肿瘤中，使用CD47-慢病毒的转基因表达水平更高，而肝脏和脾脏巨噬细胞中的表达则相对于对照组显著降低。研究还通过基于抗体的SIRPα相互作用抑制实验来验证其特异性。第二项研究利用人源CD47来提高慢病毒在肝脏基因转移的效率。在确定了肝脏巨噬细胞会清除静脉注射的慢病毒后，研究发现CD47-慢病毒增加了对肝细胞的基因转移，同时减少了对巨噬细胞的转移。这些实验在两种小鼠模型中进行：一种是能表达与人源CD47结合的SIRPα的NOD小鼠，另一种是亲和力较弱的C57BL/6小鼠。结果显示，CD47-慢病毒在C57BL/6小鼠中的清除率更高。其安全性和有效性在与人类CD47和SIRPα序列同源性更高的非人灵长类动物中得到了进一步证实。这些研究表明，展示CD47能够保护像慢病毒这样的有膜病毒免受巨噬细胞的清除，从而增强基因转移疗法的功效。与慢病毒类似，在临床上具有重要意义的腺相关病毒载体（AAV）上展示“自身”肽，在体外也导致了AAV的吞噬易感性降低。由于AAV没有膜包被，研究人员将“自身”肽直接引入AAV2的衣壳蛋白中，并用甘氨酸-丝氨酸接头（linker）连接以确保衣壳稳定并最小化病毒滴度的损失。这种插入对转导效率几乎没有影响，但与对照组AAV2相比，在人类巨噬细胞中，病毒的摄取量降低了多达10倍。当用抗SIRPα抗体进行阻断后，这种差异再次消失。 AAV的尺寸仅为20纳米，而慢病毒约为100纳米。鉴于CD47-SIRPα是吞噬摄取的特异性抑制剂，而非内吞作用的抑制剂，迄今为止CD47偶联病毒的研究结果，共同凸显了巨噬细胞对纳米颗粒进行吞噬的高效性。在细胞生物学文献中，吞噬作用常被认为仅与较大的实体（颗粒、凋亡细胞或微生物）相关，但早期对尺寸差异巨大的颗粒进行的实验，并未充分考虑到颗粒浮力的差异和其他尺寸效应。如果很少有小颗粒沉降，那么被摄取的自然就少。然而，浮力在体内并不重要。在上述纳米颗粒和病毒的研究中，肝脏和脾脏中的巨噬细胞之所以突出，是因为这些巨噬细胞排列在这些组织的血管壁上，从而能够直接、即时地接触到静脉注射的颗粒。尽管如此，巨噬细胞仍然存在于所有组织中，并且通常是肿瘤或穿刺/损伤部位等病灶处的主要细胞类型。摄取途径对于最终结果也很重要：例如，吞噬体（phagosomes）比内涵体（endosomes）对货物的氧化和破坏性更强。所有这些因素都对数十亿剂作为疫苗注射的病毒（例如，强生或牛津-阿斯利康新冠疫苗中由腺病毒递送的DNA）具有深远影响。可溶性CD47-SIRPα拮抗剂增强吞噬作用 CD47在细胞表面普遍表达，但早在几十年前，人们不仅记录了CD47在卵巢癌中的过表达，而且在CD47序列被测定之前，用于肿瘤成像的抗体靶向最终也被证明能抑制吞噬作用。随后，针对其他癌症的CD47抗体靶向研究也相继展开，并有证据表明在人类肿瘤异种移植模型中存在治疗窗口，尽管最初尚不清楚这种IgG是抑制了吞噬作用，还是激活了FcR驱动的吞噬作用，或是两者兼有。此外，一项关于在同系小鼠肿瘤模型中使用抗小鼠CD47治疗的研究，在后来的重复性验证中显示，抗CD47单药治疗没有任何抗肿瘤效果的迹象，反而显示出贫血副作用。这种单药治疗的负面结果在很大程度上也反映在了临床抗癌实践中，并且这与CD47基因敲除小鼠几乎正常（仅有极小缺陷且无明显贫血）的事实似乎是一致的。后一项由免疫学实验室得出的观察结果，一度引起了血液学家们对CD47所谓“自身标记”功能的极大怀疑。与单药治疗形成对比的是，将拮抗CD47-SIRPα巨噬细胞检查点与一个“吃我”信号相结合的策略展现出了巨大的潜力，并催生了对可溶性拮抗剂研究的爆炸性增长。这些拮抗剂的范围从临床上的各种IgG设计和重组蛋白，到小分子肽，它们都作为可能的药物，对多种血液和实体恶性肿瘤显示出不同程度的疗效。目前最先进的抗CD47疗法是一种名为magrolimab（或Hu5f9-G4）的人源化IgG4单克隆抗体，它能结合CD47并抑制其与SIRPα的结合，但由于IgG4与巨噬细胞FcR的亲和力较弱，因此不会主动激活巨噬细胞。然而，CD47在体内几乎所有细胞上的表达构成了一个“抗原库”（antigen sink），导致magrolimab等CD47靶向抑制剂的非特异性结合，从而引发了不可避免的在靶毒性，例如贫血和血小板减少症。为解决这一安全问题，正在进行的努力包括开发对CD47具有强结合力但对人红细胞亲和力低的纳米抗体。靶向SIRPα受体可能更为安全，因为其表达更具限制性，尽管SIRPα的表达不仅限于髓系细胞，也延伸到了如上皮细胞等其他细胞。一些研究确实表明，抗SIRPα阻断与抗CD47同样有效，但能维持安全的血液学指标。一项工程化巨噬细胞的研究进一步证明，将SIRPα阻断与用肿瘤靶向IgG预激活FcR相结合，在缩小已形成的肿瘤方面是有效的。最近，研究人员基于CD47上与SIRPα结合的β-发夹环结构，开发出了多价的8个氨基酸组成的“纳米自身”（nano-Self）拮抗剂。这些肽的变体能够有效阻断CD47-SIRPα的相互作用，并在低至5 nM的浓度下，增强人类巨噬细胞对经抗体调理的人红白血病细胞的内化。同一项研究中的其他观察结果，进一步证实了巨噬细胞上的CD47能与同一细胞上的SIRPα发生顺式相互作用，传递一种自抑制信号，这与早前的观察结果一致。然而，并非所有将可溶性CD47多肽添加到培养的巨噬细胞中的研究都显示出吞噬作用的增强。奇怪的是，一项早期的研究报告称，用细菌表达的人源CD47蛋白，在体外反而降低了小鼠巨噬细胞对胶体乳液的吞噬作用。后续其他团队的研究表明，CD47的相互作用能力需要一种细菌所缺乏的翻译后N-末端修饰才能得到改善，并且特定的人-鼠CD47-SIRPα相互作用本身就特别弱，此外，可能还需要对目标进行IgG调理才能揭示出CD47-SIRPα阻断的效果。所有这些仍然是该领域未来发展中需要重点考虑的因素。图3：用于免疫治疗的SIRPα-CD47可溶性拮抗剂肿瘤细胞表达巨噬细胞检查点CD47以抑制吞噬作用。单独的IgG抗体调理作用因CD47的“别吃我”信号而不足以引发有效的吞噬。但多种策略可以拮抗这种抑制。目前至少有三种免疫治疗策略正在临床前和临床研究中进行：抗CD47或抗SIRPα的抗体、作为抑制剂的可溶性蛋白版本，以及相关的“自身”肽拮抗剂。小分子（绿色三角）最终可能被开发出来抑制CD47的转录，但仍需要一个“吃我”信号。结论 SIRPα-CD47轴正成为一个在递送和治疗等多种应用中越来越有吸引力的靶点。展示CD47或相关肽段的纳米颗粒和病毒被巨噬细胞识别为“自身”，从而延迟了这些颗粒的吞噬，延长了循环时间，并增加了染料、药物和基因的靶向递送。未来需要进一步的研究来理解这些纳米颗粒和病毒上的促吞噬信号（即调理作用和蛋白质冠的形成）。与此同时，旨在增强吞噬作用（特别是对癌细胞的吞噬）的可溶性拮ក抗剂正在持续开发和探索中，这展示了该研究领域发展的双重用途。在全身性注射拮抗剂（如抗CD47 IgG）后，限制其脱靶效应仍然是挑战。至少有一项近期的有趣尝试是使用纳米颗粒来同时阻断CD47并调理癌细胞，但这当然要求纳米颗粒既能躲避巨噬细胞，又能接触到肿瘤细胞。小尺寸有助于渗透到实体瘤中，而最近合成的一种紧凑的环状“纳米自身”肽已被证明能在体外增强原代巨噬细胞对经单抗靶向的黑色素瘤的吞噬，为体内的疗效测试奠定了基础。 CD47-SIRPα信号轴的双向应用策略对比对比维度策略一：增强递送 (模拟“别吃我”信号) 策略二：增强吞噬 (阻断“别吃我”信号) 核心思想为药物/基因载体穿上“自身”隐身衣，使其逃避免疫系统清除。撕掉癌细胞的“自身”伪装，使其暴露给免疫系统攻击。关键分子工具 CD47蛋白或其衍生的“自身”肽，直接偶联在纳米载体（如纳米颗粒、病毒）表面。可溶性拮抗剂，如：抗CD47/SIRPα抗体 (Magrolimab)；重组蛋白/“纳米自身”拮抗肽作用机制载体表面的“自身”肽激活巨噬细胞SIRPα的抑制性信号通路，从而抑制对载体的吞噬作用。拮抗剂阻断癌细胞CD47与巨噬细胞SIRPα的结合，从而解除对癌细胞吞噬作用的抑制。主要应用领域纳米药物递送(延长循环，增强肿瘤靶向)基因治疗(保护病毒载体，提高转导效率) 癌症免疫治疗(特别是与“吃我”信号药物联用，治疗血液瘤和实体瘤) 主要挑战与副作用需确保修饰不影响载体自身的功能；蛋白质冠等其他清除机制的影响尚不明确。严重的在靶脱瘤毒性 (on-target, off-tumor toxicity)因健康细胞（尤其是红细胞）也表达CD47，导致贫血、血小板减少等副作用。

Field Knowledge · 2025-06-14

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