底物构象转换决定P450酶的立体选择性：分子动力学揭示二聚化反应的精妙机制

本文信息

标题：Substrate Conformational Switch Enables the Stereoselective Dimerization in P450 NascB: Insights from Molecular Dynamics Simulations and Quantum Mechanical/Molecular Mechanical Calculations
作者：Tai-Ping Zhou, Jianqiang Feng, Yongchao Wang, Shengying Li,* and Binju Wang*
发表时间：2024年4月9日
单位：厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室、理论与计算化学福建省重点实验室，中国；山东大学微生物技术国家重点实验室，中国
期刊：JACS Au 2024, 4, 1591−1604
DOI：https://doi.org/10.1021/jacsau.4c00075
引用格式：Zhou, T.-P.; Feng, J.; Wang, Y.; Li, S.; Wang, B. Substrate Conformational Switch Enables the Stereoselective Dimerization in P450 NascB: Insights from Molecular Dynamics Simulations and Quantum Mechanical/Molecular Mechanical Calculations. JACS Au 2024, 4, 1591−1604.

摘要

P450 NascB催化cyclo-(L-tryptophan-L-proline) (1)的偶联反应，通过分子内C−N键形成和分子间C−C偶联生成(−)-naseseazine C (2)。透彻理解其催化机制对于工程化或设计P450催化的C−N二聚化反应至关重要。通过结合MD模拟、QM/MM计算和增强采样方法，我们系统评估了近期研究提出的多种可能机制。研究表明，最有利的反应路径始于从N7−H向Cpd I的氢原子转移。随后，底物自由基发生关键的构象转换，从底物1中N7的Re-face转换到Si-face。底物1的Si-face构象通过蛋白质环境和吲哚环与血红素卟啉之间的π−π堆积相互作用得到稳定。接下来，底物1自由基与底物2之间通过自由基攻击机制发生分子间C3−C6′键形成。底物1自由基的构象转换不仅降低了分子间C3−C6′键形成的能垒，还产生了与实验观察一致的正确立体选择性。此外，我们评估了铁-超氧物种的反应性，表明其活性不足以引发从底物吲哚NH基团的氢原子夺取。我们的模拟提供了关于P450酶如何精确控制分子内C−N环化和分子间C−C偶联的全面机制见解。当前发现与现有实验数据一致，强调了底物动力学在控制P450催化中的关键作用。

核心结论

构象转换是关键：底物自由基从Re-face到Si-face的构象转换（能垒仅6.3 kcal/mol）是实现正确立体选择性的决定性步骤
反应路径确定：最有利路径为N7−H氢原子转移到Cpd I（pathway B），而非N1−H转移（pathway A）
关键不在首步最低，而在整条路径可行：虽然N1−H夺氢的首步能垒更低（13.8 kcal/mol），但后续步骤全部陷入高能垒死端；N7−H路径首步能垒为19.0 kcal/mol，却能沿着可持续推进的反应坐标走完整个二聚化过程
蛋白质环境至关重要：Val236、Lys289等残基通过氢键和疏水相互作用稳定Si-face构象，π−π堆积进一步稳定了构象
铁-超氧物种不参与：ferric-superoxide物种的反应性不足（能垒超过26.0 kcal/mol），无法引发反应

背景

色氨酸连接的二聚二酮哌嗪（DKP）衍生物是一类具有独特结构架构和广泛生物活性的天然产物，展现出抗癌、抗肿瘤、抗病毒和神经保护活性。细胞色素P450酶（CYPs），作为一个依赖血红素的酶超家族，已被证明在DKPs的生物合成中起到关键作用。

近期，两种同源P450酶NascB和NznB被鉴定可催化cyclo-(L-tryptophan-L-proline) (1)的二聚化，分别生成(−)-naseseazine C (2)和(+)-naseseazine B (3)。这些转化涉及分子内C−N偶联和分子间C−C偶联，这是P450催化中独特的反应类型。

scheme1

Scheme 1：NascB和NznB催化的二聚化反应。NascB催化生成(−)-naseseazine C (2)，而同源酶NznB生成(+)-naseseazine B (3)，两者具有相反的立体化学。

Qu及其合作者表征了另一种同源酶NasF5053，它对(1)表现出高催化活性。值得注意的是，双突变体S284A-V288A主要生成化合物(2)。该突变体与天然底物复合物的高分辨率晶体结构（1.68 Å）显示，活性位点被两个(1)分子占据，每个占据一个独立的口袋。底物1通过一系列氢键网络（来自K289残基）固定，而底物2则通过G286和E314稳定。

fig1

图1：NasF5053的晶体结构（PDB ID: 6VZB）与两个底物(1)的复合物，右侧框显示活性位点的放大视图。关键氢键用虚线表示，距离以Å为单位。可以看到底物1的吲哚N1−H接近血红素Fe（约2.96 Å），而底物2位于另一个口袋，通过Gly286和Glu314稳定。

关键科学问题

尽管前期研究提供了机制见解，但P450催化DKPs生物合成的分子机制尚未完全阐明，特别是关于以下几个关键问题：

氢原子夺取的位点：从吲哚N1−H（pathway A）还是从二酮哌嗪N7−H（pathway B）？晶体结构显示N1−H更接近Cpd I，但MD模拟表明底物可能重新定位使N7−H靠近
立体选择性的控制：如何确保N7自由基从Si-face攻击C2=C3双键，生成正确的S构型？
蛋白质环境的作用：蛋白质环境如何影响区域选择性和立体选择性的C−N和C−C偶联？
构象动力学的重要性：底物和中间体的构象变化在催化循环中起什么作用？

这些问题的解答需要超越静态晶体结构和气相DFT模型计算，必须结合蛋白质环境、动力学采样和精确的QM/MM能量计算。

创新点

多尺度计算策略：结合200 ns MD模拟、QM/MM几何优化、umbrella sampling增强采样，系统探索了反应机制
蛋白质环境的显式处理：显式纳入了双底物结合口袋、Val236与Lys289等关键氢键位点，以及底物与血红素之间的π−π堆积，从而避免仅凭气相或静态结构判断机制
构象转换的发现：揭示了底物自由基Re-face到Si-face的构象转换是控制立体选择性的关键步骤，这一机制在之前研究中被忽略
机制的定量比较：通过精确的能垒计算排除了多种可能路径，确定了最有利的反应机制
铁-超氧物种的评估：证明了ferric-superoxide物种不参与反应，排除了一种可能的氧化剂

研究内容

针对上述科学问题，本研究系统评估了两种可能的反应机制：

scheme2

Scheme 2：P450 NascB催化二聚化的两种可能机制。Pathway A：从吲哚N1−H夺取氢原子，然后进行分子内C−N环化和分子间C−C偶联；Pathway B：从二酮哌嗪N7−H夺取氢原子，随后的反应路径类似。本研究通过QM/MM计算评估了这两条路径的可行性。

计算方法概述

本研究采用多层次计算策略，核心设置可整理为下表：

模块	具体设置	在本文中的作用
MD模拟	基于PDB 6VZB建模，补全缺失残基并构建Cpd I；蛋白质采用AMBER ff14SB，底物采用GAFF；进行3次独立的200 ns NPT生产模拟	识别底物1的两种结合模式，并判断N1−H与N7−H哪一个更可能靠近氧化中心
QM/MM计算	QM区包含血红素、Cpd I氧原子、两个底物与近端半胱氨酸模型；几何优化采用UB3LYP-D3BJ/def2-SVP，单点能采用def2-TZVP；MM区包括蛋白质、离子与12 Å内水分子	计算各条反应路径的能垒，比较N1−H与N7−H起始机制的可行性
Umbrella sampling	以C2−C3−C4−C5二面角为CV，范围从−90.6°到110.4°；相邻窗口间隔3°；每窗口10 ns；力常数为200 kcal/mol/Å；用WHAM重建PMF	定量评估自由基从Re-face切换到Si-face的构象自由能面

fig2

图2：Cpd I与底物的QM/MM优化活性位点结构。（a）Conf-a构象中，底物1的吲哚N1−H与Cpd I形成氢键（1.91 Å），并主要由Lys289稳定；（b）Conf-b构象中，约70 ns MD后底物1重新定位，转而由DKP N7−H与铁氧形成氢键（2.00 Å），并由Val236稳定。两种构象里，底物2的位置变化都较小。

底物结合模式：两种关键构象

三次独立的200 ns MD模拟揭示了底物1（Sub1）的两种代表性结合模式：

Conf-a（0-70 ns）：

吲哚N1−H与Cpd I形成氢键（类似晶体结构）
底物1通过Lys289的氢键相互作用稳定
这种构象相对不稳定，约70 ns后转变为Conf-b

Conf-b（70-200 ns）：

DKP N7−H与铁氧（FeIV=O）形成氢键
底物1通过Val236的氢键相互作用稳定
底物2（Sub2）位置变化较小
这种构象更稳定，暗示N7−H可能是氢原子夺取的位点

Pathway A：吲哚N1−H氢夺取（被排除）

基于Conf-a构象，我们首先探索了从吲哚N1−H夺取氢原子的pathway A。

fig3

图3：Pathway A的QM/MM能量曲线。从N1−H的氢原子夺取能垒为13.8 kcal/mol，生成吲哚自由基中间体Int1a（相对于RCa高3.1 kcal/mol）。

HAA步骤（RCa → TS1a → Int1a）：

能垒：13.8 kcal/mol
产物Int1a能量：比RCa高3.1 kcal/mol
自旋布居分析：自由基离域在吲哚环上，C3（−0.43）和N1（−0.22）上有显著布居

然而，从Int1a出发的所有可能路径都动力学上不可行：

OH反弹到N1：能垒超过30.0 kcal/mol
OH反弹到C3：能垒超过40.0 kcal/mol（底物定位不利）
从N7−H夺取氢生成双自由基：能垒超过50.0 kcal/mol
与Sub2的C3−C6′键形成：能垒超过50.0 kcal/mol

质子化方案也不可行：

吲哚自由基的$pK_a$比实验环境（约7.5）低约4.8个单位
质子化是吸热的（6.55 kcal/mol）
QM计算显示质子化吲哚自由基在所有反应中都有高能垒

结论：Pathway A从N1−H夺取氢原子会生成死端中间体Int1a，无法进行后续反应，因此被排除。

Pathway B：二酮哌嗪N7−H氢夺取（最优机制）

基于Conf-b构象，我们探索了从DKP N7−H夺取氢原子的pathway B。

fig4

图4：Pathway B的QM/MM能量曲线。从N7−H的氢原子夺取（TS1b，19.0 kcal/mol）生成二酮哌嗪自由基Int1b。从Re-face的直接C2−N7环化（TS2b，23.4 kcal/mol）生成R-构型的Int2b，但后续C3−C6′偶联能垒过高（40.0 kcal/mol），表明Re-face路径不可行。

fig5

图5：Pathway B关键物种的QM/MM优化结构。显示了RCb、TS1b、Int1b、TS2b和Int2b的几何结构，标注了关键原子的自旋布居和键长（单位：Å）。为清晰起见，只显示了相关的氢原子。

第1步：HAA从N7−H开始（RCb → TS1b → Int1b）：

能垒：19.0 kcal/mol
产物Int1b能量：比RCb高16.5 kcal/mol
自旋布居分析：一个电子从Sub1转移到卟啉基团，形成Fe(IV)−OH状态

第2步：Re-face直接由N7进攻C2（Int1b → TS2b → Int2b）：

能垒：23.4 kcal/mol（相对于RCb）
产物Int2b：C2保持R构型（错误立体化学）
关键问题：从Int2b出发的C3−C6′偶联能垒为40.0 kcal/mol，过高！

Re-face路径失败的原因：

Int2b中N1−C2−N7−C5二面角为−131.3°，新形成的五元环有显著环张力
C3−C6′距离较远，不利于偶联

两条主路径的关键信息对照表

路径	起始夺氢位点	首步能垒	中间体命运	是否能完成后续反应	结论
Pathway A	吲哚N1−H	13.8 kcal/mol	生成吲哚自由基Int1a	否。OH rebound、双自由基形成、C3−C6′偶联都需要30–50 kcal/mol以上高能垒	首步虽低，但整体是死路
Pathway B（Re-face直走）	DKP N7−H	19.0 kcal/mol	生成N7中心自由基Int1b	部分可行，但直接Re-face关环后得到错误立体化学，且C3−C6′偶联高达40.0 kcal/mol	需要先构象切换，不能直接反应
Pathway B（Si-face切换后）	DKP N7−H	19.0 kcal/mol，随后经6.3 kcal/mol构象转换	形成Si-face自由基Int1c	是。N7进攻C2、C3−C6′偶联、再芳构化三步都可顺利推进	全文支持的最优机制

关键发现：Re到Si的构象转换

受先前研究启发，我们探索了二酮哌嗪自由基的柔性构象，并通过umbrella sampling计算C2−C3−C4−C5二面角旋转对应的PMF：

fig6

图6：Re构象到Si构象的自由能面与代表性结构。（a）PMF曲线以C2−C3−C4−C5二面角为反应坐标，显示旋转能垒仅为6.3 kcal/mol，且Si构象比Re构象低0.4 kcal/mol；（b）Si构象的活性位点结构中，二面角增大到101.0°，使N7可以从Si-face进攻C2，且该自由基构象由Val236、Lys289及与血红素的π−π堆积共同稳定。

关键发现：

构象转换能垒很低：仅6.3 kcal/mol
Si-face构象更稳定：比Re-face低0.4 kcal/mol
蛋白质环境的作用：
- Val236和Lys289通过氢键稳定
- 吲哚环与血红素卟啉之间的π−π堆积相互作用（距离约3.3 Å）
- 非键相互作用能：Si-face为−53.5 kcal/mol，Re-face为−55.1 kcal/mol（相当）
构象转换的选择性：只有自由基能够轻易转换，未反应的底物1在两种结合模式下都难以转换（热力学不利）

200 ns无约束MD验证了Si-face构象的稳定性（RMSD < 1.5 Å）。

从Si-face构象的完整反应路径

fig7

图7：从“Si”构象出发的Pathway B完整能量曲线。包括N7从Si-face攻击C2（TS2c，21.8 kcal/mol），生成S-构型的吡咯并吲哚啉自由基Int2c；随后C3−C6′偶联（TS3c，23.0 kcal/mol）和最后的再芳构化（TS4c，20.9 kcal/mol）。

从Si-face出发的反应步骤：

步骤2：N7从Si-face攻击C2（Int1c → TS2c → Int2c）：

能垒：21.8 kcal/mol（相对于RCb）
TS2c中C2−N7距离缩短到2.26 Å（从Int1c的3.19 Å）
产物Int2c：C2为S构型（正确立体化学！）
Int2c能量：比RCb高2.4 kcal/mol
自旋布居：C3位点携带最多自旋布居（−0.62），有利于后续C3−C6′偶联

步骤3：发生分子间C3−C6′偶联（Int2c → TS3c → Int3c）：

能垒：23.0 kcal/mol（相对于RCb）
机制：自由基介导，而非阳离子Friedel-Crafts机制
C3−C6′距离：3.50 Å（远短于C3−C7′的4.84 Å）
C3−C7′偶联的能垒：30.7 kcal/mol（更高，与实验一致）
Int3c能量：比RCb高14.7 kcal/mol

步骤4：完成再芳构化（Int3c → TS4c → Int4c）：

从C6′−H到Cpd II的HAT
能垒：20.9 kcal/mol（相对于RCb）
最终产物Int4c：比RCb低53.9 kcal/mol（放热）

fig8

图8：Si-face路径关键物种的QM/MM结构。显示了构象转换后的Int1c（二面角103.2°）、N7攻击C2的TS2c、吡咯并吲哚啉自由基Int2c（C3上自旋−0.62）、C3−C6′偶联的TS3c、以及最终产物Int4c的几何结构和自旋布居。

Si-face路径的优势：

Int2c中C3−C4−N7−C7二面角为174.4°，环张力显著降低
C3−C6′距离更短，几何排布也明显优于Re-face关环后得到的Int2b
π−π堆积相互作用进一步稳定Int2c
正确的S立体化学与实验完全一致

O-取代底物为何无反应性

Qu及其合作者测试了一种O-取代底物（O-sub）类似物，但未观察到反应性。为理解这一实验观察，我们进行了200 ns MD模拟。

fig9

图9：O-取代底物在活性位点中的不利结合模式。（a）NascB中测试的O-取代底物类似物；（b）MD模拟得到的Cpd I与O-sub代表性结构。可以看到N7−H远离Cpd I，平均距离约10 Å，且取代氧原子在活性中心不形成氢键。

MD结果：

体系在60 ns后达到稳定收敛（RMSD分析）
O-sub的N7−H远离Cpd I，平均距离约10 Å
取代的氧原子不形成任何氢键
结论：O-底物的不适当结合构象使其极不利于从N7−H引发HAA，解释了其无反应性

铁-超氧物种的反应性评估

最近研究表明铁-超氧中间体可能作为氧化剂促进环状二肽的二聚化。我们评估了ferric-superoxide (FeIII−OO•−)介导的HAA可行性。

fig10

图10：ferric-superoxide物种的结构、反应性与键解离能比较。（a）不同自旋态的QM/MM优化结构中，OSS、3和5分别代表开壳层单重态、三重态和五重态，且基态为OSS；Fe上的自旋布居为−1.00，O10和O11上分别为0.54和0.48。（b）从OSSRCc出发的HAA扫描曲线显示，N1−H夺氢能垒超过26.0 kcal/mol。（c）键解离能比较表明，N1−H1键为89.6 kcal/mol，FeIII−OOH的O−H键为69.4 kcal/mol，而Cpd II的O−H键为91.1 kcal/mol。