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附录：预反应态vs自由态：用双态MD梳理SDR“葫芦口袋”精准打开大位阻芳香酮入口
本文信息
- 标题: Rational Design of Dehydrogenase/Reductases Based on Comparative Structural Analysis of Prereaction-State and Free-State Simulations for Efficient Asymmetric Reduction of Bulky Aryl Ketones
- 作者: Bing-Mei Su, Ze-Hui Shao, Ai-Peng Li, Muhammad Naeem, Juan Lin, Li-Dan Ye, Hong-Wei Yu
- 发表时间: 2019年12月4日
- 单位: 浙江大学生物工程研究所、福州大学化学工程学院、浙江工业大学药学院、西北工业大学生命科学学院（中国）
- 引用格式: Su, B.-M., Shao, Z.-H., Li, A.-P., Naeem, M., Lin, J., Ye, L.-D., & Yu, H.-W. (2020). Rational Design of Dehydrogenase/Reductases Based on Comparative Structural Analysis of Prereaction-State and Free-State Simulations for Efficient Asymmetric Reduction of Bulky Aryl Ketones. ACS Catalysis, 10(1), 864-876. https://doi.org/10.1021/acscatal.9b04778
Q&A
- Q1: 为什么选择T态/F态比较分析而不是直接的自由能计算？
- A1: T态/F态比较分析的优势在于能够直观地揭示哪些残基导致了预反应态难以形成。当两种模拟模式下的结合模式差异显著时，说明底物难以自发进入反应构象，而残基构象差异最大的位置就是改造靶点。这比复杂的自由能计算更直接、更易于指导实验设计。
- Q2: 为什么$k_\text{cat}$提高的同时$K_m$也增加了？
- A2: $k_\text{cat}$和$K_m$的同时增加表明非催化构象（noncatalytic conformation）的占比降低。虽然$K_m$升高意味着底物亲和力降低，但在工业应用中高底物浓度可以弥补这一不足。更重要的是，高$k_\text{cat}$代表更高的催化效率，且较低的亲和力还可以缓解底物抑制问题。
- Q3: 这种策略对其他类型的酶是否适用？
- A3: 该策略的核心思想——比较有/无约束条件下的底物结合模式差异——具有较好的普适性。对于任何具有明确反应几何要求的酶（如需要特定底物-辅因子距离），都可以应用类似的分析方法。但对于反应机制复杂或多步反应的酶，可能需要调整约束条件的设置。
- Q4: 如何避免扩大结合口袋后对映选择性下降？
- A4: 关键是同步调节两个空腔的相对大小，而非单纯扩大其中一个。根据Prelog规则，需要在扩大容纳大取代基的空腔的同时，通过引入大残基或极性残基来调整另一个空腔的大小和化学环境，以维持或提高对映选择性。
完整突变筛选数据
Table 1：位点145和188的突变筛选（全细胞催化）
| 酶 | 描述 | 1a转化率 | 1a ee | 2a转化率 | 2a ee |
|---|---|---|---|---|---|
| E | EbSDR8 | >99% | >99%(R) | ND | NA |
| Mu0 | E-G94A/S153L | >99% | >99%(R) | 8.0% | >99%(R) |
| Mu1 | Mu0-H145A | >99% | >99%(R) | >99% | >99%(R) |
| Mu2 | Mu0-H145C | >99% | >99%(R) | >99% | >99%(R) |
| Mu3 | Mu0-H145G | >99% | >99%(R) | 93% | >99%(R) |
| Mu4 | Mu0-Y188A | >99% | 89%(R) | 25% | 22%(R) |
| Mu5 | Mu0-Y188C | 11% | >99%(R) | 12% | 95%(R) |
| Mu6 | Mu0-Y188G | >99% | 87%(R) | 14% | 18%(R) |
| 酶 | 描述 | 3a转化率 | 3a ee | 4a转化率 | 4a ee |
|---|---|---|---|---|---|
| E | EbSDR8 | 4.0% | >99%(R) | ND | NA |
| Mu0 | E-G94A/S153L | 38% | >99%(R) | 35% | 67%(S) |
| Mu1 | Mu0-H145A | 92% | >99%(R) | >99% | 51%(S) |
| Mu2 | Mu0-H145C | 93% | >99%(R) | >99% | 82%(S) |
| Mu3 | Mu0-H145G | 74% | >99%(R) | >99% | 40%(R) |
| Mu4 | Mu0-Y188A | 95% | >99%(R) | >99% | >99%(S) |
| Mu5 | Mu0-Y188C | 63% | >99%(R) | >99% | 94%(S) |
| Mu6 | Mu0-Y188G | 84% | >99%(R) | >99% | >99%(S) |
| 酶 | 描述 | 5a转化率 | 5a ee | 6a转化率 | 6a ee |
|---|---|---|---|---|---|
| E | EbSDR8 | ND | NA | ND | NA |
| Mu0 | E-G94A/S153L | ND | NA | ND | NA |
| Mu1 | Mu0-H145A | 90% | 94%(R) | ND | NA |
| Mu2 | Mu0-H145C | ND | NA | ND | NA |
| Mu3 | Mu0-H145G | 59% | >99%(R) | ND | NA |
| Mu4 | Mu0-Y188A | 95% | >99%(R) | ND | NA |
| Mu5 | Mu0-Y188C | ND | NA | ND | NA |
| Mu6 | Mu0-Y188G | 92% | 96%(R) | ND | NA |
ND = 未检测到；NA = 不适用
关键观察：
- H145位点突变（→A/C/G）显著提高对邻卤代苯乙酮（1a、2a）的活性
- Y188位点突变虽然提高活性，但可能降低对映选择性（如2a的ee从>99%降至22%）
- 对于底物4a，H145G突变甚至导致对映选择性反转（从S变为R）
- 单点突变均无法使酶还原二芳基酮6a
Table 3：针对6a的组合突变
| 酶 | 描述 | 6a转化率 | 6a ee |
|---|---|---|---|
| Mu7 | Mu0-H145A/Y188F | 12% | 62%(R) |
| Mu8 | Mu0-H145C/Y188F | 4.4% | >99%(R) |
| Mu9 | Mu0-H145G/Y188F | 24% | 11%(S) |
| Mu10 | Mu0-H145F/Y188A | 94% | 91%(R) |
| Mu11 | Mu0-H145F/Y188C | ND | NA |
| Mu12 | Mu0-H145F/Y188G | 93% | 84%(R) |
| Mu13 | Mu0-G94R/H145F/Y188A | 37% | >99%(R) |
| Mu14 | Mu0-G94Q/H145F/Y188A | 99% | 98%(R) |
| P | PpYSDR | 44% | 41%(S) |
| Mu15 | P-M85A | 91% | 93%(S) |
| Mu16 | P-M85G | >99% | 92%(S) |
| Mu17 | P-M85S | >99% | 96%(S) |
设计逻辑：
- H145F保留芳香环以与底物形成π-π相互作用
- Y188A/G扩大C2腔以容纳大取代基
- G94Q/R调节C1腔大小和极性以优化对映选择性
完整动力学参数
Table 2：表观动力学参数
| 底物 | 酶 | 描述 | $K_m$ (mM) | $k_\text{cat}$ (1/s) | $k_\text{cat}/K_m$ (1/mM/s) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1a | E | EbSDR8 | 0.22 | 0.020 | 0.11 |
| 1a | Mu0 | E-G94A/S153L | 0.15 | 0.10 | 0.70 |
| 1a | Mu1 | Mu0-H145A | 0.21 | 0.97 | 4.6 |
| 1a | Mu2 | Mu0-H145C | 0.23 | 0.28 | 1.2 |
| 1a | Mu3 | Mu0-H145G | 1.3 | 1.2 | 0.93 |
| 2a | E | EbSDR8 | 0.020 | 0.010 | 0.54 |
| 2a | Mu0 | E-G94A/S153L | 0.70 | 0.030 | 0.050 |
| 2a | Mu1 | Mu0-H145A | 0.090 | 1.1 | 12 |
| 2a | Mu2 | Mu0-H145C | 0.040 | 0.15 | 3.7 |
| 2a | Mu3 | Mu0-H145G | 2.0 | 0.69 | 0.35 |
| 3a | E | EbSDR8 | 0.10 | 0.010 | 0.14 |
| 3a | Mu0 | E-G94A/S153L | 0.090 | 0.070 | 0.81 |
| 3a | Mu1 | Mu0-H145A | 0.30 | 0.75 | 2.5 |
| 3a | Mu2 | Mu0-H145C | 0.060 | 0.070 | 1.2 |
| 3a | Mu4 | Mu0-Y188A | 0.55 | 0.51 | 0.91 |
| 4a | E | EbSDR8 | NA | NA | NA |
| 4a | Mu0 | E-G94A/S153L | 0.010 | 0.030 | 5.5 |
| 4a | Mu4 | Mu0-Y188A | 0.18 | 25 | 140 |
| 4a | Mu6 | Mu0-Y188G | 0.40 | 52 | 130 |
| 5a | E | EbSDR8 | 0.030 | 0.020 | 0.63 |
| 5a | Mu0 | E-G94A/S153L | 0.090 | 0.060 | 0.66 |
| 5a | Mu4 | Mu0-Y188A | 0.54 | 1.23 | 2.29 |
| 6a | E | EbSDR8 | 0.030 | 0.010 | 0.42 |
| 6a | Mu0 | E-G94A/S153L | NA | NA | NA |
| 6a | Mu10 | Mu0-H145F/Y188A | 2.0 | 4.2 | 2.1 |
| 6a | Mu14 | Mu0-G94Q/H145F/Y188A | 1.6 | 2.2 | 1.3 |
| 6a | P | PpYSDR | 0.44 | 0.23 | 0.53 |
| 6a | Mu17 | P-M85S | 0.45 | 1.1 | 2.4 |
关键发现：
- Mu1对2a的$k_\text{cat}$比Mu0提高37倍（从0.030到1.1 s$^{-1}$）
- Mu4和Mu6对4a的$k_\text{cat}/K_m$达到约140 (1/mM/s)，是Mu0的25倍以上
- $k_\text{cat}$和$K_m$同时增加表明非生产性结合减少
亲和力测定数据
Table 4：脱辅酶和全酶对底物的解离常数
| 底物 | 酶 | $K_d^{\text{apo}}$ (mM) | $h_{\text{apo}}$ | $K_d^{\text{holo}}$ (mM) | $h_{\text{holo}}$ |
|---|---|---|---|---|---|
| 1a | Mu0 | 0.011 | 1.17 | 0.071 | 0.68 |
| 1a | Mu1 | 0.010 | 1.45 | 0.0056 | 1.67 |
| 2a | Mu0 | 0.0023 | 0.67 | 0.037 | 0.87 |
| 2a | Mu1 | 0.0023 | 1.06 | 0.0055 | 1.69 |
| 3a | Mu0 | 0.0094 | 0.93 | 0.028 | 1.06 |
| 3a | Mu4 | 0.010 | 1.10 | 0.010 | 0.77 |
| 4a | Mu0 | 0.011 | 1.04 | 0.022 | 0.80 |
| 4a | Mu4 | 0.0059 | 0.91 | 0.0035 | 1.38 |
| 5a | Mu0 | 0.0037 | 1.25 | 0.017 | 0.65 |
| 5a | Mu4 | 0.0042 | 1.19 | 0.0075 | 1.28 |
| 6a | Mu0 | 0.0078 | 1.57 | NA | NA |
| 6a | Mu14 | 0.012 | 1.35 | 0.022 | 1.14 |
$h$ = Hill系数；$h > 1$ 表示正协同效应；$h < 1$ 表示负协同效应
关键发现：
- 突变主要影响全酶对底物的亲和力，而不是脱辅酶
- 成功突变体的$K_d^{\text{holo}}$显著降低（亲和力提高）
- Hill系数从负协同（$h < 1$）转变为正协同（$h > 1$），表明结合行为改善
MD模拟方法细节
同源建模
| 酶 | 模板PDB | 序列一致性 | VERIFY值 | ERRAT值 |
|---|---|---|---|---|
| EbSDR8/Mu0 | 4URF | 52% | 96% | 93 |
| PpYSDR | 5WQO | 39% | 88% | 89 |
T态模拟约束条件
使用谐波势施加距离约束：
\[E_{\text{restraint}} = k \cdot (r - r_0)^2\]其中：
- $k = 500$ kcal/(mol·Å$^2$)
- $r_0(\text{O}\text{sub}-\text{OH}{\text{Y156}}) = 2.8$ Å
- $r_0(\text{C}\text{sub}-\text{H18}{\text{NADH}}) = 3.0$ Å
能量分解分析
使用MM-PBSA方法计算底物结合口袋（底物6 Å范围内）残基对底物结合的能量贡献。
Mu0 vs Mu1对2a$_{\text{ProR}}$的能量贡献比较
| 残基位置 | Mu0能量(kcal/mol) | Mu1能量(kcal/mol) | 变化 |
|---|---|---|---|
| I93 | -2.5 | -1.8 | ↓ C1吸引减弱 |
| A94 | -1.8 | -1.5 | ↓ |
| S143 | -0.3 | -1.5 | ↑ 催化残基贡献增加 |
| H145/A145 | -0.8 | -0.5 | ↓ 空间位阻消除 |
| Y156 | -0.5 | -2.0 | ↑ 催化残基贡献增加 |
| K160 | -0.2 | -1.0 | ↑ 催化残基贡献增加 |
| Y188 | -2.0 | -1.8 | ↓ |
解释：突变后，催化残基（S143、Y156、K160）对底物结合的能量贡献显著增加，表明底物能够更好地进入催化构象。
实验方法
全细胞催化
- 反应温度：Mu0及其变体37°C，PpYSDR及其变体30°C
- 反应体系：50 mM底物，25 mg湿细胞，25 μL异丙醇（辅底物），总体积500 μL
- 反应时间：2 h
- 检测方法：乙酸乙酯萃取后HPLC/GC分析
动力学参数测定
- 检测波长：340 nm（NADH/NADPH）
- 消光系数：NADH ε = 6.0/mM/cm，NADPH ε = 5.3/mM/cm
- 底物浓度范围：0.2-20 mM
荧光猝灭法测定亲和力
- 脱辅酶：测定底物结合后蛋白荧光猝灭
- 全酶：测定底物结合后NAD(P)H荧光变化
- 数据拟合：Hill方程